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目的评价间充质干细胞外泌体联合胶原蛋白肽对骨性关节炎的有效性,探究可能发挥作用的相关机制。方法1.间充质干细胞、外泌体的分离鉴定组织贴壁法分离间充质干细胞,倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测表面标志CD34、CD45、CD73、CD90和CD105。差速离心法提取外泌体,透射电子显微镜观察形态;Western Blot检测表面标志CD9、CD63和CD81;纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径和数量。2.间充质干细胞外泌体联合胶原蛋白肽对骨性关节炎的有效性观察取3月龄BALB/c雄性小鼠120只,平均体重29.4g,SPF级环境饲养。(1)设计鼠骨性关节炎低温造模装置,包括控温箱、鼠固定器。取20只小鼠,随机分为正常对照组和低温处理组,每组10只,正常对照组正常饮食饮水,低温处理组右后肢每天在5~6℃条件下低温处理1h 40min,持续30d,第31d时,小鼠后肢大体观察;测量关节肿胀度;ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α、HA、Ig M含量;完整踝关节HE染色切片评价造模效果。(2)取100只小鼠,随机分为正常对照组,模型组,细胞低、中、高剂量组,外泌体低、中、高剂量组,胶原蛋白肽组,外泌体联合胶原蛋白肽组,每组10只。正常对照组正常饮食饮水,其他组进行骨性关节炎造模。31d时,细胞各剂量组分别注射1×10~4、1×10~5、1×10~6个细胞,外泌体各剂量组分别注射6μg、12μg、18μg外泌体,胶原蛋白肽组以6.06mg/Kg/d剂量灌胃,外泌体联合胶原蛋白肽组中外泌体12μg、胶原蛋白肽同上述剂量灌胃,模型组注射PBS。细胞、外泌体、PBS隔天注射一次。注射当天开始,第0d、10d、30d测量关节肿胀度,30d后,小鼠后肢大体观察;ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α、HA含量;完整踝关节HE、番红固绿、II型胶原免疫组化染色切片;OARSI组织学评分进行疗效评价。营养状态和体重变化情况;全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、GGT、TBIL、ALP、BUN、CR、UA、Cys C、CK、CK-MB、HBDH、LDH-1含量;心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、睾丸、胰腺、肠、胃、脑HE染色切片进行安全性评价。3.间充质干细胞外泌体联合胶原蛋白肽对骨性关节炎的机制研究(1)取46周龄BALB/c雄性小鼠3只,平均体重29.3g,SPF级环境饲养。实验室改良两步酶消化法分离踝关节软骨细胞,体外培养,倒置显微镜观察细胞形态;甲苯胺蓝和II型胶原免疫荧光染色;二甲基亚甲蓝显色法测定原代贴壁细胞培养液及消化液中硫酸糖胺多糖含量;软骨细胞增殖检测进行软骨细胞鉴定。(2)使用上述方法提取正常对照组、模型组、细胞高剂量组、外泌体高剂量组、胶原蛋白肽组、外泌体联合胶原蛋白肽组干预后第31d时的踝关节软骨细胞,miRNA高通量测序,筛选鉴定差异表达miRNA,GO功能注释和KEGG通路富集分析。结果1.间充质干细胞、外泌体的分离鉴定倒置显微镜下可见细胞呈梭形、漩涡状生长;流式细胞仪测得细胞阳性表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34和CD45。透射电子显微镜下可见圆盘状和杯口状囊泡;Western Blot显示CD9、CD63和CD81呈阳性表达;纳米颗粒跟踪分析仪测得粒径在80-200nm之间,颗粒数为1.8×10~9个/m L。2.间充质干细胞外泌体联合胶原蛋白肽对骨性关节炎的有效性观察(1)小鼠骨性关节炎造模结果:低温处理组踝关节肿胀明显,可见软骨面破损退化,软骨细胞增生、变性,滑膜组织变性粘连,其踝关节肿胀度高于正常对照组(P<0.001),血清中TNF-α、IL-1β和HA的含量高于正常对照组(P<0.05)。(2)间充质干细胞、外泌体、外泌体联合胶原蛋白肽、胶原蛋白肽对骨性关节炎的有效性:模型组踝关节肥大,严重畸形,细胞低剂量、胶原蛋白肽组关节轻微侧翻、伴随较明显肿胀,细胞中和高剂量、外泌体联合胶原蛋白肽、外泌体高剂量组无变形,肿胀轻微,外泌体低、中剂量组踝关节无明显变形,有轻微肿胀;第0d、10d、30d时关节肿胀度显示,间充质干细胞、外泌体、胶原蛋白肽、外泌体联合胶原蛋白肽可缓解骨性关节炎小鼠的关节肿胀;与模型组相比,间充质干细胞、外泌体、胶原蛋白肽、外泌体联合胶原蛋白肽均可降低血清中IL-1β、TNF-α含量,升高HA含量(P<0.05),降低IL-1β含量时,外泌体联合胶原蛋白肽作用大于外泌体低剂量(P<0.05);模型组软骨面严重侵蚀、缺损,软骨细胞大量减少变性,软骨组织侵蚀彻底处蛋白聚糖和II型胶原呈阴性表达。胶原蛋白肽组软骨面破损,部分软骨组织中蛋白聚糖和II型胶原呈阳性表达。细胞高剂量组软骨面较平整,可见部分蛋白聚糖和II型胶原阳性表达。外泌体联合胶原蛋白肽、外泌体高剂量组软骨面完整光滑,蛋白聚糖和II型胶原呈均匀的阳性表达;组织学评分显示,各干预组评分低于模型组(P<0.05);安全性评价结果显示,与正常对照组相比,各干预组营养状态良好,体重变化差异无统计学意义,脏器HE染色未见明显病理改变。3.间充质干细胞外泌体联合胶原蛋白肽对骨性关节炎的机制研究(1)镜下可见细胞呈梭形和铺路石样生长;细胞甲苯胺蓝染色可见蓝紫色易染颗粒,Ⅱ型胶原免疫荧光染色可见红色荧光阳性表达;原代细胞培养液和消化液中硫酸糖胺多糖含量分别为(42.41±15.00)、(65.63±10.00)mg/L;第1代细胞的活力大于第2代和原代。(2)六组软骨细胞miRNA高通量测序,共检出1122种已知miRNA,435种新预测miRNA。差异表达miRNA筛选结果显示,正常对照组vs胶原蛋白肽组、正常对照组vs外泌体联合胶原蛋白肽组、正常对照组vs外泌体高剂量组上调差异倍数最大的为novel-miR-223、novel-miR-127,模型组vs胶原蛋白肽组、模型组vs外泌体联合胶原蛋白肽组、模型组vs外泌体高剂量组上调差异倍数最大的为novel-miR-187、novel-miR-409。GO注释结果显示,各组差异表达miRNA预测靶基因的生物过程主要集中于解毒、节律性过程、生长和行为,细胞组成主要集中于突触、突触部分和超分子复合体,分子功能主要集中于抗氧化活性、电子载体活性和结构分子活性。KEGG通路富集显示,高显著性通路主要集中于轴突导向、内吞作用、溶酶体。结论1.间充质干细胞和外泌体分离提取成功。2.间充质干细胞外泌体联合胶原蛋白肽、高剂量外泌体可有效抑制骨性关节炎小鼠的滑膜炎症和软骨组织退变,保护及修复软骨细胞的生物学功能。3.间充质干细胞外泌体联合胶原蛋白肽、高剂量外泌体很可能通过影响novel-miR-223、novel-miR-127、novel-miR-187、novel-miR-409的表达来减缓小鼠骨性关节炎的病变,其中差异表达miRNA预测靶基因发挥的功能很可能涉及了关节组织细胞的生长、昼夜节律、氧化应激,参与的通路很可能与轴突导向、内吞作用有关。