牵张成骨(DO)技术已经成为一种治疗下颌骨畸形或缺损的重要方法,但固定期过长和下牙槽神经(IAN)损伤这两个问题仍是目前制约该技术推广应用的重要原因。神经生长因子(NGF)是一种在神经系统损伤的修复中发挥重要作用的因子。另一方面,NGF还参与正常骨的代谢并能促进骨修复。目前尚未见关于在DO中局部应用NGF的报道。因此本研究的主要目标是明确局部应用的NGF在兔下颌骨DO中是否具有促进新骨形成和IAN恢复的作用。本文分为6部分:1外源性hNGFβ作用于大鼠成骨细胞的体外研究目的:检测外源性hNGFβ对大鼠成骨细胞的增殖和成骨能力的效应。方法:用不同浓度的hNGFβ与原代培养的大鼠成骨细胞共培养后,检测细胞的增殖(MTT法)、碱性磷酸酶(ALP)活性、总蛋白质含量、钙结节,以及Ⅰ型胶原和骨钙素免疫细胞化学染色。结果:各浓度的hNGFβ对大鼠成骨细胞的增殖无明显作用。50 ng/ml上下浓度的hNGFβ显著提高了细胞ALP活性、总蛋白含量和Ⅰ型胶原与骨钙素的表达水平(P<0.05),而且呈一定的浓度依赖性。结论:hNGFβ能够提高大鼠成骨细胞的成骨性分泌能力,而对其增殖无明显影响。2 hNGFβ凝胶缓释系统的制备及其对成骨细胞的体外作用目的:研究胶原/纳米羟基磷灰石(Col/nHA)基卡拉胶凝胶对hNGFβ的缓释效能,了解这种缓释系统对大鼠成骨细胞成骨能力的影响。方法:以Col/ nHA(清华大学研制的一种仿生骨材料)、k-卡拉胶和0.1 mg /ml hNGFβ为原料,制备凝胶缓释材料并研究其体外释药规律。在Transwell小室中将该缓释系统与大鼠成骨细胞共培养后,检测细胞的增殖、ALP活性和总蛋白质含量。结果:该凝胶的hNGFβ释放曲线提示其存在降解性释放。携带hNGFβ的该凝胶显著提高了大鼠成骨细胞的ALP活性和总蛋白含量。结论:Col/ nHA基卡拉胶凝胶可以作为一种好的hNGFβ缓释载体;该缓释系统对远隔培养的大鼠成骨细胞的成骨能力具有促进作用。3牵张速率对兔下颌骨DO中的新生骨和下牙槽神经的影响目的:建立同时牵张双侧下颌骨的兔DO模型,了解不同牵张速度下新骨形成和下牙槽神经(IAN)的组织学变化规律。方法:以18只兔作为实验动物,建立用一体式的内置牵张器同时牵张双侧下颌骨的模型,按照不同的牵张速度(0.5,0.75或1.0 mm/12h)分组并设立只截骨的空白手术对照组。用简易感觉神经测试方法检测IAN的功能。固定期第28 d取IAN标本,行甲苯胺兰染色、Bodian氏嗜银染色和透射电镜观察。用X线、von Kossa染色和HE染色等方法研究新生骨标本的组织学特点。结果:新骨形成和IAN组织学变化规律是牵张速度依赖性的。在排除了手术直接损伤后,三种牵张速度均对IAN纤维结构有明显的应力性损伤。其中0.5 mm/12h对IAN的损伤作用最小,也最有利于新骨形成。结论:这种兔下颌骨DO模型具有很好的可靠性,适用于将来的干预性实验。0.5 mm/12h可能是最能模仿临床情况的牵张速度。4低速牵张下兔下颌骨DO的新骨形成规律探讨目的:了解在固定期不同时间,低速牵张(0.5 mm/12h)下兔下颌骨DO模型中的新骨形成规律。方法:12只兔接受速度为0.5 mm/12h的下颌骨DO。骨沉积荧光活体标记后,在固定期第0,14,28和42 d取新生骨标本。通过荧光显微镜、扫描电镜、PCNA免疫组化染色、von Kossa和HE染色等观察新生骨的组织学特点。结果:骨组织学变化是时间依赖性的,经历了从间充质细胞聚集到初步形成成熟骨的过程。结论:低速牵张下该模型的骨组织学变化符合DO一般规律。进一步说明这种动物模型是可靠的。5局部注射hNGFβ对下颌骨DO新生骨和IAN的影响目的:采用兔双侧下颌骨DO模型,研究局部注射的hNGFβ溶液对DO新生骨和IAN的组织形态的影响。方法:对20只兔实施0.5 mm/12h的双侧下颌骨DO。在固定期第1和3天,每只兔的一侧下颌骨骨痂内注射hNGFβ溶液2次(40μg/次),另一侧注射安慰剂。取材期设为固定期第14和28 d。经X线侧位片、外径测量和三点折断试验后,新生骨痂接受骨组织学定量分析,包括骨量百分比、成骨细胞密度、钙化面积比和钙化沉积速度。IAN切片行甲苯胺兰染色后进行神经纤维密度、平均髓鞘厚度测量和透射电镜观察。结果:与对照侧相比,hNGFβ注射侧的最大负载值、骨量百分比、骨沉积速度(固定期第1至11 d)、钙化面积比和神经纤维密度均明显提高(P<0.05),成骨细胞密度和平均髓鞘厚度未见明显变化。结论:局部注射的hNGFβ溶液能够促进兔下颌骨DO中新生骨的成熟和IAN的恢复,这为下颌骨DO临床上缩短固定期和修复/保护IAN提供了一种新的思路。6 Col/nHA基凝胶/hNGFβ缓释系统对下颌骨DO新生骨和IAN的作用目的:研究局部注射加载或不加载hNGFβ的Col/nHA基卡拉胶凝胶对下颌DO新生骨和IAN的组织形态的影响。方法:对16只兔实施0.5或0.75 mm/12h的双侧下颌骨DO。在固定期第1 d,一侧下颌骨骨痂内注射加载或不加载hNGFβ(20μg)的Col/nHA基凝胶,另一侧注射安慰剂。在固定期第14 d时对新生骨痂进行骨量百分比定量分析,对IAN切片进行神经纤维密度和平均髓鞘厚度测量。结果:与对照侧相比,凝胶/hNGFβ侧的骨量百分比(0.5和0.75 mm/12h速度下)和神经纤维密度(0.5 mm/12h)均明显提高。注射不含hNGFβ的凝胶对骨组织和IAN无显著作用。结论:在减少因子用量和注射次数的条件下,局部注射的Col/nHA基凝胶/hNGFβ缓释系统能够促进兔下颌骨DO中新生骨的成熟和IAN的恢复。