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口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus, FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病。FMDV衣壳由4种结构蛋白VP1,VP2, VP3, VP4各60个拷贝组成。研究表明,结构蛋白VP1富含T细胞抗原表位与B细胞抗原表位,是诱导产生中和抗体的主要成分,同时还是被宿主细胞识别的主要病原体相关模式分子,在免疫应答中发挥着主要作用。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是功能最强大的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC),通过其吞噬受体或模式识别受体捕获抗原,并将其提呈给T细胞,它能够调节机体对病原体的免疫应答,但目前还不清楚它在抗FMDV感染中的作用。实验证明,FMDV野毒株并不感染DC,但在培养基上驯化的FMDV则可以感染DC,并且与抗体结合后的FMDV也可感染DC,导致其抗原提呈功能丧失,而当DC负载灭活FMDV免疫复合物后却能够有效地刺激T细胞。众所周知,细胞免疫应答在抗病毒感染过程中发挥重要作用。被DC活化的T细胞在IL-12的作用下,可分化为Th1细胞,介导细胞免疫应答并产生调理性抗体(IgG),从而清除胞内病原体感染。而在IL-4的作用下,有利于Th细胞向Th2细胞分化,介导体液免疫应答,产生中和抗体,清除外周循环中的病原体。目前尚不清楚DC启动细胞免疫应答的机制。本研究选用VP1进行原核表达,用纯化后的VP1负载DC,再与淋巴结T细胞进行共培养,通过ELISA检测共培养物上清中IFN-y和IL-4的水平,从而研究其免疫应答机制以及DC提呈FMDVVP1抗原的途径。试验以重组质粒pUC57-VP1为模板,经过Nco I-HF和Xho I双酶切得到FMDV的VP1基因,再以相同的限制性酶对原核表达载体pET32a(+)进行消化,通过T4 DNA连接酶连接二者,并将连接产物转化到宿主菌DH5a中去,得到重组质粒pET32a(+)-VP1,再将新得到的重组质粒pET32a(+)-VP1转化到宿主菌BL21(DE3)中去,经酶切鉴定以及基因序列测定。结果表明,VP1基因定向连接到原核表达载体pET32a(+)上。将VP1基因与GenBank发表的序列进行同源性比较,证明本研究所用的基因序列与Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NYOO基因编码序列(NCBI登陆号为AY333431.1)同源性最高,可达100%。结果证明pET32a(+)-VP1重组表达菌构建成功。为鉴定pET32a(+)-VP1基因能否在大肠杆菌中进行表达,研究者对重组表达菌进行诱导表达,同时以相同的条件对空载体pET32a(+)进行诱导表达,用来作为阴性对照。SDS-PAGE电泳以及Western-blotting检测结果显示,在分子量约为43kDa处有一条明显的蛋白条带,而空载体pET32a(+)在相应的位置却未见此特异性蛋白条带。为了验证负载FMDV VP1的DC能否有效地激活淋巴结T细胞,用负载FMDVVP1的DC与淋巴结T细胞组成共培养体系,同时以DC与淋巴结T细胞共培养体系作为阴性对照,以DC作为空对照,通过ELISA检测不同时间点上清液中IFN-y和IL-4的水平。结果显示,负载FMDV VP1的DC能够有效地激活淋巴结T细胞。该结果为进一步研究DC提呈FMDVVP1的机制和新型疫苗的研制奠定了重要基础。