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支链氨基酸L-异亮氨酸作为必需氨基酸具有多种生理功能,被广泛应用于食品、医药、化妆品以及饲料等领域。微生物发酵是工业生产L-异亮氨酸的主要方式,而谷氨酸棒状杆菌是主要的生产菌种。生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌主要通过筛选和随机诱变得到,其遗传背景不明且很难通过诱变进一步提高产量。因此,通过代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸,越来越引起重视。本论文在研究延伸因子EF-G和核糖体循环因子RRF对谷氨酸棒状杆菌中L-异亮氨酸代谢的调控作用基础上,从L-异亮氨酸高产菌株IWJ001出发,利用代谢工程手段提高了L-异亮氨酸产量。主要结论如下:(1)研究发现EF-G能促进谷氨酸棒状杆菌中L-异亮氨酸的合成。将来源于谷氨酸棒状杆菌野生型ATCC13869的fus A基因和L-异亮氨酸高产菌株IWJ001的fus A1基因在IWJ001中进行表达,发现两种延伸因子EF-G和EF-G1均能提高L-异亮氨酸产量,且EF-G的效果更好;(2)研究了其他翻译相关蛋白核糖体循环因子RRF、延伸因子EF-Tu和EF-Ts对IWJ001中L-异亮氨酸合成的影响;发现RRF能促进L-异亮氨酸的合成,EF-Tu抑制L-异亮氨酸的合成,促进L-苏氨酸和L-赖氨酸的合成;EF-Ts对氨基酸的合成无显著影响;(3)通过代谢工程改造提高了谷氨酸棒状杆菌IWJ001中L-异亮氨酸产量。在谷氨酸棒状杆菌IWJ001中表达RRF和EF-G,发现L-异亮氨酸产量提升的同时其他氨基酸水平也较高;后续共表达了合成途径关键酶基因ilv BNA和辅酶基因ppnk,L-异亮氨酸产量提高了76.5%,杂酸水平明显降低;IWJ001/p DXW-8-fus A-frr-ilv BNA-ppnk在3 L罐上补料分批发酵72 h,L-异亮氨酸产量提高了39.7%,达到28.5 g/L;(4)解析了EF-G和RRF促进谷氨酸棒状杆菌L-异亮氨酸合成的机制。通过RT-PCR分析发现EF-G和RRF均能提高谷氨酸棒状杆菌L-异亮氨酸合成途径相关基因的转录水平;其表达对L-异亮氨酸合成途径关键酶的酶活有略微提高。EF-G和RRF对L-异亮氨酸合成的促进可能是通过提高其关键合成酶的转录水平和翻译水平来间接实现的。(5)验证了无抗表达系统在IWJ001中以及发酵培养基条件下的稳定性。实验结果表明IWJ001Δalr/p JYW-4和IWJ001Δalr/p JYW-4-fus A在不添加抗生素的发酵培养基中质粒是稳定存在的。