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第一部分：睾酮对小鼠卵泡体外发育的影响背景：多囊卵巢综合征是青春期及育龄期女性最常见的妇科内分泌紊乱性疾病,临床表现复杂多样,高雄激素血症是其重要特征之一。低剂量雄激素可以促进卵泡生长,而过高剂量的雄激素则会抑制卵泡选择性生长,诱导卵泡发生凋亡或闭锁,导致排卵功能障碍。本实验采用小鼠卵泡体外培养方法在体外观察高雄激素对卵泡形态学发育影响。目的：探讨高浓度睾酮对体外培养的小鼠卵泡生长发育的影响。方法：以出生后12日龄的ICR雌鼠体外培养卵泡为研究模型,将卵泡随机分为以下4个组,每组30个：正常对照组(control组),10-4mol/L睾酮处理组,10-5mol/L睾酮处理组,10-6mol/L睾酮处理组。将卵泡随机分为以下三个组,每组30个：正常对照组(control组),睾酮处理组(T组,T=10-5mol/L),雄激素受体拮抗剂氟他胺预处理后再加睾酮处理组(F+T组,F=10-5mol/L, T=10-5mol/L)。在60mm无菌细胞培养皿上进行微滴培养,每天在倒置显微镜下观察卵泡轮廓、颗粒细胞增生情况、卵母细胞形态以及有无卵母细胞逸出等,并记录卵泡存活和退化的情况。结果：10-4mol/L睾酮能抑制卵泡的生长,而10-5mol/L睾酮能够促进颗粒细胞的增殖和卵泡的生长；同时,在卵泡生长前期,睾酮能刺激卵泡的发育,在后期则呈抑制作用,即卵泡发育停滞、退化或死亡。结论：在初级和次级卵泡阶段,10-5mol/L睾酮能促进卵泡的发育,而在窦状卵泡阶段则抑制卵泡的发育。第二部分：小鼠Dennd1a基因慢病毒载体的构建背景：中国汉族妇女关于多囊卵巢综合征的一期GWAS筛选出数个PCOS的候选基因,其中DENND1A基因与PCOS的功能学研究很少,有必要构建稳定而有效的DENND1A基因重组表达载体。目的：构建表达小鼠Dennd1a基因的慢病毒载体,并鉴定其对小鼠原代膜-间质细胞的感染效率。方法：提取小鼠卵巢RNA,逆转录PCR扩增获得Dennd1a目的基因片段,EcoRI、 BstBI酶切连接慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,构建融合copGFP共表达的Dennd1a重组质粒。转化DH5a感受态细菌,挑选阳性克隆,酶切及测序鉴定正确后,将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染包装细胞293FT,包装产生病毒液,浓缩后感染体外培养的小鼠原代膜-间质细胞,测定病毒滴度后实时定量RT-PCR和蛋白印迹法检测感染后膜-间质细胞Dennd1a基因mRNA和蛋白的表达情况。结果：通过扩增获得3051bp Dennd1a cDNA片段,测序结果证实目的基因与Genebank序列完全一致。Dennd1a重组质粒经慢病毒包装后获得Dennd1a’慢病毒载体,病毒滴度为1×108ifu/mL,感染膜-间质细胞后Dennd1a基因mRNA和蛋白表达都增加。结论：成功构建小鼠Dennd1a基因慢病毒载体,并有效感染小鼠膜-间质细胞,mRNA和蛋白水平都增高,为进一步研究Dennd1a基因功能提供适合载体。