Survivin是凋亡抑制蛋白家族中最小的成员,降低细胞内源性Survivin的表达量可以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡,目前有不少抑制Survivin表达的策略,但是缺乏一种基于抗体蛋白靶向的在蛋白水平上降解Survivin的方法。Survivin普遍存在于癌细胞的细胞质(包括线粒体)和细胞核中,不同亚细胞中Survivin发挥的功能可能也有所不同。因此,本课题的目的是通过建立一种纳米抗体靶向细胞内源性Survivin泛素化降解的方法,来研究Survivin降解后对细胞凋亡和细胞生长方面的影响,进而探究Survivin在不同亚细胞定位中发挥的主要功能。基于上述目的,本研究获得了以下结果与结论:首先,建立了由泛素连接酶TRIM21介导细胞内源性Survivin降解的方法,利用Survivin的纳米抗体Nb4A对Survivin的靶向性,以及抗体Fc区与TRIM21羧基末端PRYSPRY结构域特异性结合的能力,构建了 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21系统。通过Western blot分析发现,Nb4A-Fc-T2A-TRIM21能大量降解细胞内源性Survivin蛋白,其降解Survivin的能力是Nb4A的3.72倍,TRIM21的2.84倍;并且利用蛋白酶体抑制剂MG132验证了该方法对Survivin的降解是由泛素-蛋白酶体途径介导的。其次,流式检测细胞凋亡结果显示,Nb4A-Fc-T2A-TIRM21对MCF-7细胞的凋亡率达到58.52%,然而对Survivin低表达的L-02细胞的凋亡率仅为14.56%,表明Nb4A-Fc-T2A-TIRM21可以通过降解癌细胞中的Survivin进而促进细胞凋亡。Western blot分析发现促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达量与Survivin的表达量均成反比,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达与Survivin的表达水平无显著相关性,可以初步证明Survivin是通过直接或间接地抑制Caspase途径来发挥抗凋亡功能的,是区别于Bcl-2抗凋亡蛋白家族的抗凋亡途径。最后,将Nb4A-Fc-T2A-TRIM21融合核定位信号NLS,以靶向降解细胞核Survivin。通过比较细胞凋亡率发现,Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对MCF-7细胞的促凋亡能力约是Nb4A-Fc-NLS-T2A-TRIM21-NLS 的 2.37 倍。MTT 实验发现Nb4A-Fc-NLS-T2A-TRIM21-NLS作用于MCF-7细胞48 h后,细胞存活率仅为49.44%,低于Nb4A-Fc-T2A-TRIM21组的细胞存活率(60.45%),而其对L-02细胞的增殖活性无显著影响。通过对MCF-7细胞的细胞周期分布情况以及Cyclin D1表达水平的分析发现,靶向降解细胞核Survivin后,加速了 G1期向S期的转变,而且阻滞在S期和G2期,从而抑制了细胞分裂,并且细胞核Survivin的下调很大程度上会下调Cyclin D1的表达,但降解细胞质中的Survivin却没有明显影响细胞周期的进程。综上结果表明,Survivin的双重作用与其定位息息相关,细胞质Survivin主要发挥抗凋亡功能,而细胞核Survivin主要是促进细胞增殖并且参与细胞周期的调控。本研究为精准靶向Survivin的肿瘤治疗提供了新的策略与研究基础。