促红细胞生成素/促红细胞生成素受体对肝癌细胞增殖的影响

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研究目的:促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)是内源性的促进红细胞生成的重要因子,近年来,其在多种肿瘤中表现出的促瘤作用引起了人们的广泛关注。然而,EPO及其受体(Erythropoietin receptor,EPOR)在肝癌发展中扮演的角色仍不清楚。本研究着重探讨EPO/EPOR在肝癌细胞增殖中的作用,尤其是肿瘤的缺氧微环境对此过程的影响。研究方法:1.构建小鼠肝癌皮下移植瘤模型:小鼠分为对照组,模型组和给药组,每组8只。按照课题组已发表的皮下移植小鼠肝癌H22细胞法,建立肝癌移植瘤模型。对照组同时给予生理盐水皮下注射。给药组:按1μg/kg脂氧素(Lipoxin A4,LXA4)(溶于10%乙醇)隔天腹腔注射给药。模型组:同时给予等量的10%乙醇(LXA4溶剂)。观察小鼠每天生长状况并测量肿瘤大小。14天后分别取肿瘤组织和正常肝组织进行检测。2.免疫组织化学法检测人肝癌组织,癌旁组织,小鼠移植瘤肝癌组织及正常肝组织中EPO、EPOR、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和Ki67的表达水平。3.人肝癌细胞Hep G2分别在常氧和缺氧条件下培养24、48、72h。PCR和Western Blot分别从m RNA和蛋白水平检测EPO与EPOR的表达及LXA4对它们表达的影响。4.Hep G2分别在常氧与缺氧条件下经重组人促红细胞生成素(Recombinant human erythropoientin,r Hu EPO)、可溶性促红细胞生成素受体(soluble erythropoientin receptor,soluble-EPOR)、LXA4处理24、48、72h。MTT法及(CFDA-SE标记)--流式细胞仪检测((Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester)-labeled/Flow cytometry-detected,CFSE-FCM)分别检测Hep G2细胞在以上处理后细胞生长活力与增殖分裂能力变化;5.Western Blot检测肝癌细胞Hep G2中增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的表达。6.免疫荧光法检测Hep G2细胞在常氧和缺氧下分别培养24、48、72h后EPOR的表达分布情况。研究结果:1.模型动物皮下接种H22细胞后成瘤,且随培养时间的延长,瘤块逐渐变大。给药组与模型组相比,肿瘤生长明显较慢,在移植瘤接种的第14天,肿瘤体积明显较小。结果证实,小鼠肝癌皮下移植瘤模型复制成功。2.免疫组化结果表明:人肝癌组织及小鼠皮下移植瘤组织中,EPO、EPOR、HIF-1α及Ki67均着色明显,呈阳性表达;而LXA4处理的小鼠上述各指标的表达明显弱于模型组。3.与常氧相比,缺氧培养下Hep G2细胞中EPO、EPOR m RNA及蛋白均上调。4.MTT法与CFSE-FCM检测结果均表明缺氧培养下Hep G2增殖能力明显高于常氧培养。同时,Western blotting检测显示PCNA蛋白表达增高。5.常氧条件下,r Hu EPO对Hep G2增殖无明显影响;但在缺氧培养下可显著促进Hep G2增殖,其中10 IU/ml的r Hu EPO促增殖作用最为明显;PCNA表达增高。同时,soluble-EPOR和LXA4均明显抑制缺氧诱导的Hep G2细胞的生长活力和增殖分裂增加;并抑制了PCNA表达。6.缺氧培养下,PCNA蛋白表达增高;r Hu EPO刺激后,PCNA表达增高;soluble-EPOR处理后,PCNA表达下调。7.常氧下,Hep G2细胞内EPOR主要分布于胞核,少量在胞质;缺氧刺激下,胞质和胞膜中的分布明显增多。8.在缺氧下,LXA4抑制Hep G2细胞的增殖。研究结论:在缺氧环境中,肝癌细胞高表达EPO/EPOR,后者促进Hep G2细胞的增殖;LXA4通过抑制缺氧下EPO的高表达而抑制Hep G2细胞的增殖。
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