肺动脉高压(pulmonary artery hypertension,PAH)是临床上常见的一种疾病,表现为肺动脉血管阻力持续增高,导致右心肥厚、衰竭甚至死亡。病理上主要表现为肺动脉收缩性增强、肺中小动脉血管构型重建、微血栓形成以及炎症反应,其中肺血管构型重建为主要环节。肺动脉高压发病机制复杂,近年来5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)在肺动脉高压中的作用受到广泛关注。　　 肺动脉高压患者血浆中5-HT水平明显高于正常人,而体外实验证明高浓度的5-HT能使人离体肺血管明显收缩。5-HT作为一种促有丝分裂素,由位于肺动脉平滑肌细胞膜上的5-羟色胺转运体(scrotonin transporter,5-HTT)介导进入肺动脉平滑肌细胞(pulmonary mcry smooth muscle cells,PASMCs),并通过多种信号转导途径引起PASMCs增生肥大,引起肺动脉血管壁构型重建。最近有学者研究发现,5-HT作用于5-HTT激活活性氧(reactive oxygen species,ROS)机制使ERK1/2磷酸化水平提高,进而诱导牛的PASMCs增殖。并且有学者提出ROS-HIF通路参与PASMCs增殖作用。　　 5-HT可通过诱导ROS产生,刺激新生的肺动脉血管平滑肌细胞增殖,并且ROS还参与5-HT刺激平滑肌细胞生长的过程,因此在肺动脉高压的病理过程中,ROS可能发挥了重要作用。缺氧诱导因子-1(hypoxia induced factor-1,HIF-1)与肺动脉高压的发生密切相关,在缺氧诱导的肺动脉高压中发挥重要作用。研究表明不仅在缺氧诱导的大鼠肺动脉高压模型中,在野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的大鼠肺动脉高压模型中也有HIF-1α白表达水平的增高,表明HIF-1α在缺氧诱导的肺动脉高压中发挥重要作用。做为HIF-1α的下游效应因子,血管内皮生长因子(Vascular endothdifl growth factor,VEGF)也参与了PAH的疾病发生。VEGF通过影响ERK1/2磷酸化水平,参与平滑肌细胞的增殖、重构,而这一过程是否有5-HTT的参与,目前尚未见报道。　　 目的：　　 我们前期工作发现氟西汀通过抑制5-HTT可发挥抗肺动脉高压的作用,但是该机制是否有HIF-1α和VEGF的参与,目前尚无报道。因此,本实验拟用MCT诱导的大鼠肺动脉高压模型,对VEGF、HIF-1α、ROS在肺动脉高压中的作用及氟西汀抗肺动脉高压的具体机制进行研究。　　 实验材料与方法：　　 一、建立MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型　　 体重200g左右的雄性Wistar大鼠32只,随机分4组:Control组(Control)、MCT组(MCT)、MCT+氟西汀低剂量组(MCT-F2)和MCT+氟西汀高剂量组(MCT-F10)。MCT-F2组和MCT-F10组大鼠每天分别给予氟西汀2mg/kg和10mg/kg灌胃,各组大鼠常规饲养3周。　　 二、大鼠肺动脉压、右心室肥厚指数检测　　 给药21天后,戊巴比妥钠40mg/kg麻醉大鼠。将与压力换能器连接并充满肝素盐水的PE250管插入插入右侧颈外静脉。插入过程中当压力基线上升并出现肺动脉波形时,开始描记肺动脉压。将大鼠处死取出心脏,仔细分离右心室(RV)和左心室+室间隔(LV+S),滤纸吸水后,分别称量RV和LV+S的重量,RV/(LV+S)即为右心指数。　　 三、肺组织形态学及肺血管重构检测　　 取大鼠右肺下叶固定,HE染色。在光学显微镜下对肺肌型小动脉中膜厚度进行测量分析。每组取4只大鼠,每只大鼠取外径在50～100μm的20个肺肌型小动脉,测其管壁厚度和血管外径,用下面公式评估肺血管壁厚度:　　 血管壁增厚指数=(血管壁厚度×2)/血管外径×100％四、Western Blot和免疫组织化学方法检测肺组织HIF-1α和VEGF蛋白表达　　 五、大鼠肺组织中ROS的定性及定量检测　　 使用GENMED活体组织氧化应激活性氧初级荧光测定试剂盒,采用组织切片定性及组织匀浆定量方法进行检测,在荧光显微镜及荧光分光光度计下进行定性及定量检测,激发波长490nm,散发波长520nm,绿色荧光增强表明活性氧含量高。　　 六、Western Blot方法检测肺组织磷酸化ERK1/2蛋白表达　　 七、免疫组织化学方法检测肺组织Ki67蛋白表达　　 实验结果：　　 一、氟西汀对MCT诱导肺动脉高压大鼠平均肺动脉压及右心指数的影响　　 与Control组相比,经MCT处理的三组大鼠的体重明显降低,Control组体重为275.6±38.7g,MCT组、MCT-F2组和MCT-F10组体重分别为229.9±32.3g、243±26.7g和233.7±31.9g。氟西汀治疗组与MCT组体重无明显差异。与Control组比较,MCT组大鼠的右心肥厚指数和平均肺动脉压则明显升高。Control组的右心肥厚指数为26.6％±2.7％,MCT组则为54.4％±9.3％(P＜0.01):Control组平均肺动脉压为16.6±3.0mmHg,MCT组则为30.5±4.9mmHg(P＜0.01),这提示肺动脉高压病理模型成功。与MCT组相比,MCT-F10组的右心肥厚指数和平均肺动脉压明显降低,且有明显的统计学意义;而MCT-F2组与MCT组无明显差异。　　 二、氟西汀对MCT诱导肺动脉高压大鼠肺小血管重构的影响　　 与Control组相比,MCT组肺小动脉血管壁明显增厚,肺小动脉壁厚度由14.7±4.1μm增至29.8±7.0μm(P＜0.01);血管壁增厚指数由41.0％±11.5％提高到78.2％±18.4％(P＜0.01)。而氟西汀10mg/kg可显著降低MCT引起的肺血管壁增厚,肺小动脉壁厚度和血管壁增厚指数分别降至22.1±3.2μm(P＜0.01)和59.8％±8.7％(P＜0.01)。　　 三、氟西汀对MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织形态学影响　　 大鼠肺组织切片HE染色结果显示,Control组大鼠肺小动脉管壁薄、管腔大,平滑肌细胞排列规则均匀,内皮细胞完整连续。MCT组大鼠肺组织结构不清,肺小动脉管壁明显增厚,血管平滑肌细胞增生肥大,管腔明显变小甚至形成管腔闭锁,肺小动脉内皮细胞连续性破坏,细胞肿胀变性,并且肺小血管周围有大量炎性细胞浸润。与MCT组比较,MCT-F2组形态学上没有明显改观,而MCT-F10组肺组织结构清楚,肺血管管壁变薄、平滑肌细胞排列规则,血管周围炎性细胞减少。以上结果都表明MCT可诱发明显的肺血管构型重建,氟西汀明显抑制了MCT引起的肺血管构型重建。　　 四、氟西汀对MCT诱导的大鼠肺组织HIF-1α蛋白表达的影响　　 用Western Blot方法检测大鼠肺组织中HIF-1α蛋白的表达。结果显示,与Control组相比,MCT组大鼠肺组织中HIF-1α蛋白水平明显提高,由1.91±0.17提高到2.81±0.41(P＜0.01)。MCT-F2组HIF-1α蛋白水平为2.26±0.58,MCT-F10组明显降低,为1.95±0.51(P＜0.05)。为了明确HIF-1α在肺组织中表达部位,用免疫组织化学的方法检测HIF-1α在肺组织中的表达情况。在光镜下(×200)观察可见HIF-1α在细胞核中表达,Control组很少有阳性细胞表达,MCT组肺动脉周围阳性细胞数则明显增多。MCT-F2组与MCT组无明显差别,MCT-F10组阳性细胞数与MCT组比较显著减少。　　 五、氟西汀对MCT诱导的大鼠肺组织VEGF蛋白表达的影响　　 用Western blot方法检测肺组织中VEGF蛋白表达。结果表明,与Control组相比较,MCT组VEGF蛋白的表达明显增高,由0.55±0.24增加到1.07±0.30(P＜0.01)。氟西汀10mg/kg可以明显的抑制VEGF表达,蛋白水平降至0.82±0.22(P＜0.01)。氟西汀2mg/kg对VEGF表达几乎没有影响,表达水平为1.01±0.29(P＞0.05)。用免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中VEGF蛋白的表达,镜下可见VEGF主要表达于细胞浆及细胞膜,Control组大鼠肺组织中气道上皮细胞和血管内皮细胞均有VEGF表达。MCT可以明显刺激VEGF的蛋白表达,在肺血管上皮细胞,肺血管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞及气道上皮细胞中都有明显的棕黄色阳性细胞。与MCT组相比,MCT-F2组无明显改变,而MCT-F10组的大鼠肺组织切片中VEGF染色阳性细胞明显减少,提示氟西汀10mg/kg可抑制VEGF在肺组织中的表达。　　 六、氟西汀对MCT诱导的大鼠肺组织ROS含量的影响　　 野百合碱可以明显的促进大鼠肺组织ROS的产生。与Control组相比,MCT组ROS含量Control组为0.39±0.16,MCT组0.76±0.43(P＜0.05)。与MCT组相比,氟西汀可以降低肺组织ROS含量,MCT-F2组下降为0.56±0.39,但无统计学意义(P＞0.05);MCT-F10组下降为0.43±0.07(P＜0.05)。这表明氟西汀10mg/kg可以明显抑制MCT诱导大鼠肺组织中ROS的产生。　　 肺组织切片中ROS的定量检测结果则表明ROS在肺组织中主要表达于肺血管平滑肌层及气道的平滑肌层。Control组大鼠肺组织中ROS在肺血管中的表达水平很低,MCT可以明显的促进肺血管平滑肌中ROS的表达,在荧光显微镜下可以观察到耀眼的绿色荧光。氟西汀10mg/kg可以明显的抑制MCT诱导的ROS,在荧光显微镜下MCT-F10组的绿色荧光强度明显减弱,但强于Control组。　　 七、氟西汀对MCT诱导的大鼠肺组织磷酸化ERK1/2的影响　　 Western blot结果显示,与Control组相比MCT组大鼠肺组织中ERK1/2磷酸化水平明显升高,由0.42±0.17升到0.82±0.32(P＜0.01),氟西汀10mg/kg可以明显拮抗MCT诱导的ERK1/2磷酸化水平升高0.46±0.19(P＜0.01)。氟西汀2mg/kg对ERK1/2磷酸化水平无明显影响,为0.52±0.24(P＞0.05)。　　 八、氟西汀对MCT诱导的大鼠肺组织中Ki67表达的影响　　 免疫组织化学研究结果表明,与Control组相比MCT组大鼠的肺组织中Ki67表达水平增高,阳性细胞表达率由4.51±1.81上升为23.6±5.10(P＜0.01)。与MCT组相比,氟西汀2mg和10mg分别将其降至22.65±5.82和4.17±1.91(P＜0.01)。　　 结论：　　 一、本研究明确MCT可导致大鼠肺组织中ROS产生增多,使HIF-1α和VEGF蛋白表达水平增高。ROS、HIF-1α-VEGF通路参与肺动脉高压的病理过程。　　 二、选择性5-HT再摄取抑制剂氟西汀减少肺组织中ROS生成,抑制HIF-1α及VEGF蛋白表达,通过ERK1/2通路抑制肺血管平滑肌细胞增殖,发挥明显抗肺动脉高压作用。