肿瘤细胞的耐药性有单药耐药和多药耐药两种形式，多数是多药耐药，多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤对多种不同结构、不同机制的抗癌药物具有耐药性。药物耐药性的产生主要与细胞内药物的浓度与分布改变，细胞内抗氧化体系激活，DNA损伤修复系统活化和细胞外基质等各种因素相关。维拉帕米(Verapamil，VER)是早期发现的可以通过改变细胞内药物浓度而降低肿瘤耐药性的药物，实验研究表明，VER可以明显提高多种肿瘤细胞对化学药物的敏感性。体外研究发现VER有效逆转肿瘤耐药的浓度是6.0～10.0μmol/L，但是VER的静脉安全浓度是1.0～2.0μmoL/L，超过安全浓度会导致窦性心动过缓、房室传导阻滞等严重的毒副作用，这成为限制它作为肿瘤耐药逆转剂在临床中广泛应用的主要原因。考虑到VER静脉浓度范围的限制以及其对肿瘤多药耐药良好的逆转效果，在国内外首次开展了一系列的VER联合化疗药物的经动脉介入灌注治疗研究。动物实验研究发现，经靶动脉灌注VER后，局部组织中药物浓度是静脉血液中药物浓度3-10倍，是逆转耐药所需要浓度的4-20倍，并且未出现心血管相关的毒副作用。在此基础上，临床研究中，在国内外首次通过VER联合TACE，有效得提高了HCC的临床化疗疗效，总有效率71.4％，患者1年生存期达到了81.8％，超过了标准化疗药物治疗疗效，但仍有近30％患者治疗无效，这可能与VER逆转化疗耐药能力个体化差异有关。　　P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，即多药耐药蛋白1(multidrug resistance protein1，MDR1)，被认为是VER逆转肿瘤化疗耐药的主要作用靶点之一。P-gp是ABC超家族，即ATP结合盒式蛋白(ATP-bindingcassette transporter，ABC)中的一个跨膜蛋白，可以将药物逆浓度从细胞内转运到细胞外，从而导致肿瘤细胞产生耐药性。研究表明，VER可以使ATP水解释放的能量不能与P-gp的运输功能耦合，即引起ATP的无效水解，P-gp外排能力丧失;或者VER与药物竞争P-gp，使被外排到细胞外的药物减少;亦或者VER与化学药物联合可以抑制P-gp表达等。有报道在胃癌阿霉素耐药细胞株及卵巢癌紫杉醇耐药细胞株中未检测到P-gp高表达，Chi等通过实验证实VER逆转肺癌细胞多药耐药与P-gp表达无关。这说明，除了通过P-gp外，VER逆转肝癌细胞的耐药性可能存在其它途径。　　CDKN2B（细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子2B，又称P15、INK4b），属INK4蛋白家族，又称多肿瘤抑制基因(MTS1)，可以抑制细胞周期依赖激酶4(Cyclin dependent kinase4，CDK4)或6的活性而抑制细胞周期，引起细胞的G1期阻滞，从而抑制肿瘤的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。有研究表明:上调CDKN2B的表达可促进肝癌耐药细胞HepG2/DDP G1期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖，提高细胞内化疗药物的蓄积和潴留。但对于该基因是否参与维拉帕米逆转化疗耐药的调控尚未见报道。本研究通过筛选出有效预测VER逆转化疗耐药能力个体差异的分子标志物，将为TACE+VER联合使用提供临床疗效预测手段和理论依据，对于完善维拉帕米个体化治疗有着重要意义。　　第一章 肝癌细胞中P-gp表达水平与维拉帕米逆转化疗耐药能力相关性研究　　目的:探讨在多种肝癌细胞系中，P-gp表达水平与维拉帕米逆转肝癌细胞化疗耐药能力差异关联性。　　方法:1.qRT-PCR技术检测P-gp编码基因MDR1在4种肝癌细胞系中的表达水平;2.CCK8法检测4种肝癌细胞系（SMMC-7721、BEL-7402、HepG2、QGY-7703）对3种化疗药物(L-OHP，ADM，5-FU)药物敏感性;3.CCK8法检测4种肝癌细胞系对VER联合3种化疗药物药物敏感性;4.维拉帕米逆转化疗耐药能力判定。　　结果:1.P-gp的表达水平在4种肝癌细胞系中的表达水平差异明显，与QGY-7703细胞相比，其余3种肝癌细胞MDR1表达水平明显升高，HepG2细胞最为明显;2.HepG2和BEL-7402对奥沙利铂耐药性大于SMMC-7721和QGY-7703;BEL-7402、SMMC-7721、HepG-2对阿霉素耐药性大于QGY-7703，SMMC-7721对5-氟尿嘧啶耐药性显著大于其它3种细胞;3.用固定浓度的VER(4.91ug/ml)联合化疗药物处理每种细胞，4种肝癌细胞系针对3种化疗药物的IC50值均不同程度下降，提示维拉帕米均不同程度提高了上述3种化疗药物的敏感性;4.在BEL-7402细胞中，VER逆转ADM化疗耐药能力最强(Relative IC50=16.52)，与SMMC-7721细胞相比有显著性差异(Relative IC50=1.53)。　　结论:MDR1/P-gp表达水平与VER逆转ADM化疗耐药能力之间无相关一致性。　　第二章 介导维拉帕米逆转肝癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选、确证及机制研究　　目的:筛选出介导维拉帕米逆转肝癌细胞化疗耐药能力差异的基因并确证，探讨其作用机制。　　方法:1.基于illumina技术测序平台的转录组测序和差异基因的筛选;2.qRT-PCR技术检测8个候选基因在肝癌细胞中的表达;3.western blot法检测CDKN2B/P15蛋白在肝癌细胞中的表达;4.CDKN2B基因表达沉默及过表达后，CCK8法检测VER逆转ADM化疗耐药能力变化;5.CDKN2B基因表达沉默及过表达后，AnnexinⅤ-PI双染法检测VER促肝癌细胞凋亡能力的变化。　　结果:1.发现共有135个基因在BEL-7402中表达差异显著（表达上调/下调）(log2(awei/a)＞1，padj＜0.05)且在SMMC-7721中无明显差异，在这135个基因中，有65个基因在BEL-7402细胞株中VER使用后显著高表达。最终选择了候选基因8个，文献检索这些基因功能均报道与耐药相关，这8个候选基因分别为SLC8A1、DLC-1、FST、CDKN2B、UCHL1、IDO-2、miR-675、lnc-H19;2.qRT-PCR验证表明经过VER处理后，CDKN2B，SLC8A1，UCHL1，FST和IDO-2的表达存在差异，其中CDKN2B、UCHL1、FST基因在7721ADM和7721ADM+VER组表达无明显差异，在7402ADM和7402ADM+VER组表达明显升高，而CDKN2B基因差异最为明显（**p＜0.01），本研究着重从CDKN2B出发，阐明其调控VER耐药逆转作用的可能机制;3.CDKN2B/P15蛋白在7721ADM和7721ADM+VER组表达无明显变化，7402ADM+VER组和7402ADM组比较表达明显升高（*p＜0.05）;4.在BEL-7402细胞中，表达沉默CDKN2B基因(siR-CDKN2B)，VER逆转ADM化疗耐药能力明显降低，在SMMC-7721细胞中，过表达CDKN2B基因(PCMV6-CDKN2B)，VER逆转ADM化疗耐药能力明显增强;5.过表达CDKN2B基因(PCMV6-CDKN2B)后，VER促进ADM肝癌细胞凋亡能力明显增强，表达沉默CDKN2B基因（siR-CDKN2B）后，VER促进ADM肝癌细胞凋亡能力较前下降。　　结论:CDKN2B介导了维拉帕米逆转肝癌细胞ADM化疗耐药能力差异，通过改变CDKN2B基因表达水平，可明显改变VER逆转ADM化疗耐药及促进细胞凋亡能力，升高该基因的表达水平，这种能力明显增强，反之，降低该基因表达水平，这种能力有所下降。　　第三章 临床研究P-gp、CDKN2B基因在肝癌组织样本中的表达　　目的:临床研究P-gp、CDKN2B基因在肝癌极端病例（治疗明显好转组/治疗疾病进展组）组织样本中的表达。　　方法:1.选取2015.1-2015.12入住本院就诊中晚期原发性肝癌患者22例，均经肝脏穿刺技术提取病变标本，病理证实为肝细胞肝癌，每位患者每月介入1次共介入2-4次，评估患者治疗疗效，分为两组:维拉帕米抗耐药治疗有效组(治疗明显好转病例，CR)12例，维拉帕米抗耐药治疗无效组（治疗疾病进展病例，PD）10例;2.免疫组化法检测P-gp、CDKN2B基因在两组肝癌组织样本中的表达。　　结果:1.P-gp蛋白主要表达于癌细胞胞浆中，在癌组织及癌旁组织中，有效组的P-gp蛋白平均光密度值与无效组比较无明显差异;2.p15蛋白主要表达于癌细胞胞核及胞浆中，在癌组织中，有效组的P15平均光密度值明显高于无效组（**p＜0.01）。　　结论:1.维拉帕米抗耐药治疗有效组P-gp蛋白表达水平与无效组比较无明显差异;2.维拉帕米抗耐药治疗有效组P15蛋白表达水平明显高于抗耐药治疗无效组。