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背景意义:CDK2是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的一种,在真核细胞的周期调控中起重要作用,它能作用于周期蛋白并控制S期染色体DNA的复制。在肿瘤细胞中通过下调CDK2的活性能显著抑制细胞增殖,从而达到控制肿瘤生长的目的。宫颈癌与骨肉瘤是人类常见的恶性肿瘤,研究发现在宫颈癌细胞与骨肉瘤细胞中,cdk2的表达量较高。RNA干扰(RNAi)技术是利用双链小RNA高效特异性降解细胞内同源mRNA,从而抑制特定基因表达的技术。因此应用RNAi技术抑制宫颈癌细胞与骨肉瘤细胞中cdk2基因的表达,从而抑制其细胞增殖,这将为宫颈癌与骨肉瘤的治疗提供新的方法。本研究旨在构建一种能够在宫颈癌细胞与骨肉瘤细胞中有效介导cdk2基因表达的RNAi载体,通过转染后评价其抑制细胞增殖的效果,这为宫颈癌与骨肉瘤的基因治疗提供新的思路与方法。研究方法:(1)根据cdk2基因的表达序列及短发卡RNA(shRNA)的设计原则,化学合成编码shRNA的寡核苷酸序列,然后将其克隆到BS/U6载体的U6启动子下游,通过基因重组的方法构建RNAi质粒。通过基因测序,确定RNAi载体构建成功。(2)以BS/U6载体做对照。应用脂质体将构建成功的RNAi质粒转染入培养的Hela细胞与U-2 OS细胞中。(3)通过RT-PCR与Western blotting分析转染的RNAi质粒对Hela细胞与U-2 OS细胞中cdk2基因表达的抑制效果。(4)应用MTT与流式细胞术(FACS)方法分析转染的RNAi质粒通过抑制Hela细胞与U-2 OS细胞中cdk2的表达从而对细胞生长状态及细胞周期的影响。研究结果:(1)通过测序分析可知,RNAi质粒构建成功,无基因突变,目的基因的核苷酸序列成功插入父本质粒BS/U6中。(2)在mRNA水平,通过RT-PCR技术分析得知:在构建的RNAi质粒转染入细胞3天后,在Hela细胞中,转染了四种RNAi质粒的细胞中cdk2基因的表达水平分别下降了73.1%,86.1%,88.4%和77.1%;在U-2 OS细胞中,cdk2基因的表达水平分别下降了76.8%,84.3%,84.6%和75.8%。(3)在蛋白表达水平,通过Western blotting分析方法可知构建的四种RNAi质粒能够有效抑制Hela细胞与U-2 OS细胞中CDK2蛋白的表达。在Hela细胞中,四种质粒的抑制效果在分别为:68.2%, 72.7%,77.3%和41%;而在U-2 OS细胞中,四种质粒的抑制效果在分别为37.5%,53.4%,57.3%和33.3%。(4)通过MTT分析结果可知转染了四种RNAi质粒的细胞的生长受到抑制,在转染72h后,在Hela细胞中,四种RNAi对细胞的抑制效果分别为55.2%,62.3%,61.9%和45.8%;在U-2 OS细胞中,四种RNAi对细胞的抑制效果分别为34.3%,35.6%,34.9%和28.8%。(5)对细胞周期分析中,FACS的实验结果表明转染了四种RNAi质粒的细胞的细胞周期受到一定的影响。在转染了四种RNAi质粒的Hela细胞中,处于G1期的细胞的分别增加了6.88%,7.99%,9.17%和6.25%而处于S期的细胞分别减少了3.65%,8.57%,13.16%,和5.12%;在U-2 OS细胞中,转染了四种RNAi质粒的细胞中,处于G0G1期的细胞分别增加了2.5%,8.21%,4.59%和2.48%,处于S期的细胞分别减少了2.12%,9.46%,6.44%和2.11%。研究结论:(1)本研究成功构建了能在肿瘤细胞中有效介导cdk2表达的siRNA表达载体,为制备针对其他基因的RNAi载体提供了基础,也为研究其他基因功能提供了有力工具。(2)DNA载体介导的肿瘤细胞内RNAi有效抑制了细胞增殖,这将为宫颈癌与骨肉瘤等肿瘤的基因治疗提供了新的思路和策略。