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番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)是一种马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus)马铃薯Y病毒科(family Potyviridae)植物病毒,是全球番木瓜种植业中最具毁灭性的一种病害。核内涵体蛋白a蛋白酶(nuclear inclusion protein a protease, NIa-Pro)是马铃薯Y病毒属病毒(Potyvirus)编码的最主要的蛋白酶,参与病毒的复制、决定宿主的专一性以及宿主防御等。作为多功能蛋白,NIa-Pro需要和一些宿主蛋白相互作用来发挥其功能。迄今为止,相关的研究还未见报道。基于前期工作对PRSV海南分离物(PRSV-HN)全基因组测序和结构分析以及PRSV寄主番木瓜病毒诱导cDNA文库的构建,本研究应用一种胞质酵母双杂交系统一Sos恢复系统(Sos recruitment system, SRS)筛选获得17种与PRSV NIa-Pro发生相互作用的宿主因子,其中6种互作宿主因子基因编码的氨基酸序列分别与高等植物的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose1,6bisphosphate aldolase class1protein, FBPA1)、类金属硫蛋白(metallothionein-like protein, MTL)、真核翻译起始因子3G (eukaryotic translation initiation factor3G protein, EIF3G、GTP绑定蛋白(GTP-binding family protein, GTPBP)、FK506绑定蛋白(fk506-binding protein, FK506BP)和蛋氨酸亚砜还原酶B1(methionine sulf oxide reductase B1protein, MsrB1)具有较高同源性,分别命名为PaFBPA1、PaMTL、PaEIF3G、PaGTPBP、PaFK506BP和PaMsrB1,其余11种为未知编码氨基酸基因序列。为进一步验证SRS的结果,本研究利用双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)荧光检测验证了上述这6种宿主因子分别可以与PRSV NIa-Pro在洋葱表皮细胞中发生互作,与Sos恢复系统筛选结果一致。通过对生物信息学分析发现,PaFBPA1和PaMsrB1分别含有预测的68和70个氨基酸残基的叶绿体定位信号肽。分别构建PaFBPA1、PaMsrB1及NIa-Pro与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)融合的植物瞬时表达载体,并转化番木瓜原生质体后进行激光共聚焦显微镜观察。结果表明：NIa-Pro定位于细胞质中,而PaFBPA1和PaMsrB1均定位于番木瓜原生质体的叶绿体中。利用BiFC进一步分别证明了PaFBPA1-NIa-Pro和PaMsrB1-NIa-Pro的互作发生在番木瓜叶绿体中。根据对NIa-Pro、PaFBPA1和PaMsrB1蛋白的结构分析,分别设计了PRSV NIa-Pro的4种缺失突变体,PaFBPA1的3种缺失突变体和2种点突变体,PaMsrB1的3种缺失突变体和4种点突变体,并将这些突变体构建相应的诱饵载体和文库载体进行SRS分析。结果表明：PRSV NIa-Pro的C端结构域(residues133-239)为其分别与PaFBPA1和PaMsrB1互作的必须结构域；PaFBPA1的中间结构域FBP-2(residues231-280)为其与PRSVNIa-Pro互作的必须结构域,而Va1257和Gln26o为互作所必须的关键位点；PaMsrB1的中间部分结构域MsrB-2(residues112-175)是其与PRSV NIa-Pro互作的必须结构域,而Thr133和His173是互作所必须的关键位点。NIa-Pro是Potyvirus编码的最主要的蛋白酶,本研究初步分析了PaFBPA1, PaMsrB1分别与NIa-Pro间的互作是否是基于发生酶切反应的相互作用。通过原核表达含GST标签的NIa-Pro融合蛋白和含GST标签His标签的PaFBPA1和PaMsrB1的融合蛋白,结合体外酶切后进行免疫印迹(Western blot)检测,结果表明：在体外PaFBPA1被NIa-Pro酶切,与PaFBPA1含有与NIa-Pro的蛋白酶识别位点有关；而PaMsrB1在体外没有被NIa-Pro酶切。利用qRT-PCR分析了在PRSV感染番木瓜过程中PaFBPA1和PaMsrB1mRNA的表达情况。分析结果表明：在接种PRSV6d后,番木瓜叶片中PaFBPA1的表达量开始下降,10d降至最低,12d后开始升至对照水平,并在20d后保持一个高于对照的表达水平。同时,在接种PRSV6d后,番木瓜叶片中PaMsrB1的表达量开始下降,8d降至最低,10d时开始明显上调,并高于对照水平,12d时上调至最高水平,约为对照表达水平的2倍,15d后开始下调并维持在一个较高的表达水平,约为对照水平的1.4倍。产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)是病毒与植物相互作用早期的一个重要生理反应。本研究利用酶联免疫吸附技术(ELISA)分析了在PRSV感染番木瓜过程中番木瓜ROS的表达情况。分析结果表明：接种4d后ROS物质的表达量开始上调,10d升至最高,15d后开始明显下调,但仍然保持在一个较高水平,因此,PRSV感染导致了番木瓜植株体内ROS的积累。在逆境下,植物蛋氨酸亚砜还原酶B1(MsrB1)能专一修复被ROS氧化的叶绿体信号识别颗粒蛋白,使其所在蛋白质重新恢复功能和活性。由于PaMsrB1与NIa-Pro的互作亚细胞定位在番木瓜叶绿体中,因此,PaMsrB1与PRSVNIa-Pro的互作可能影响了PaMsrB1在叶绿体中清除由于PRSV感染引起的ROS的还原修复功能,从而影响叶绿体的正常代谢。本研究获得的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBPA)是卡尔文循环中的一个关键酶,在高等植物叶绿体中参与调节光合作用,PaFBPA1与NIa-Pro的互作定位在番木瓜叶绿体中,且是基于发生酶切反应的相互作用,因此,他们的互作可能会影响PaFBPA1在宿主光合作用中正常功能的发挥和导致PaFBPA1的降解,而导致症状的产生。本研究的结果不仅为PRSV病毒蛋白与宿主因子互作在宿主防御和症状产生中发挥的作用提供了新的线索,也为设计出一种通过调控寄主因子而达到防治PRSV的抗病毒新策略提供理论和实践基础。