花生四烯酸是一种重要的不饱和脂肪酸，是人体的必需不饱和脂肪酸。但是在人体内不能从头合成。相对于传统的生物提取法，新兴的微生物发酵生产法更具优势。而被孢酶属的深黄被孢霉就是其中一种重要霉菌。在深黄被孢霉代谢产生花生四烯酸的过程中，△6脂肪酸脱氢酶是不可缺少的一种限速酶，因此，研究△6脂肪酸脱氢酶在代谢过程中的调控作用具有重大意义。本文为探讨深黄被孢霉△6脂肪酸脱氢酶在原核、真核表达系统中的表达行为，分别构建△6脂肪酸脱氢酶基因的原核和酵母表达载体，并在大肠杆菌和酵母表达系统中进行表达，为△6脂肪酸脱氢酶基因在不同表达系统中的高效表达和表达调控的研究奠定基础。根据pET-32a(+)载体序列多克隆位点，参照GenBank报道的△6脂肪酸脱氢酶基因序列，利用Oligo6软件设计了一对扩增△6脂肪酸脱氢酶基因序列的特异性引物。提取深黄被孢霉基因组RNA，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增△6脂肪酸脱氢酶基因，与pMD18-T载体连接，转化E.coli DH5α，筛选构建的重组质粒，经PCR、酶切、测序鉴定后，以ECoRⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒和表达载体pET-32a(+)，T4连接酶连接,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),筛选构建质粒，IPTG诱导表达电洗脱法纯化表达蛋白，进行SDS-PAGE电泳并经Westernbloting鉴定△6脂肪酸脱氢酶融合蛋白的抗原性；参考pGAPZαA载体序列多克隆位点，根据△6脂肪酸脱氢酶基因序列设计引物，以构建质粒为模板，PCR扩增目的△6脂肪酸脱氢酶基因。PCR产物与pGAPZαA酵母表达载体经EcoR I、Xho I双酶切，T4连接酶连接，转化E.coliDH5α，筛选重组子。将重组质粒经限制性内切酶AvrⅡ线性化，电转化至P.pastoris SMD1168中，高浓度的ZeocinTM抗性筛选高拷贝转化子，用ECoRⅠ和XhoⅠ基因特异引物进行PCR鉴定，SDS-PAGE分析并经Western bloting鉴定△6脂肪酸脱氢酶融合蛋白的免疫学活性。本研究克隆了深黄被孢霉△6脂肪酸脱氢酶基因，成功构建了重组质粒，获得了稳定表达的pET32(+)大肠杆菌原核表达体系，在IPTG浓度为1.0mmoL/L、诱导6h表达水平最高，表达出的70kDa蛋白（含6个组氨酸标签）。Western bloting分析结果表明该蛋白可与△6脂肪酸脱氢酶发生特异性反应，具有较好的抗原性；此外，以pGAPZαA为表达载体，SMD1168毕赤酵母为受体系统，构建了高效、分泌型的△6脂肪酸脱氢酶毕赤酵母表达系统。经SDS-PAGE检测，在相对分子质量约65kDa左右处可见目的蛋白表达条带。Western bloting鉴定结果显示，表达蛋白具有良好的免疫学活性，这为进行△6脂肪酸脱氢酶的结构与相关功能研究和基因工程生产奠定了基础。