miRNAs在寻常型银屑病患者外周血单个核细胞中的表达及竹黄颗粒对差异性miRNAs和细胞因子的干预作用研究

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目的:运用niRNA基因芯片技术检测寻常型银屑病患者(Psoriasis Vulgaris,PV)外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中小分子RNA(microRNAs, miRNAs)的表达谱系,筛选其与正常人PBMC中差异性表达的miRNAs,对部分差异性miRNAs进行荧光实时定量PCR(RealTime quantitative PCR,RT-qPCR)验证。运用定量蛋白芯片技术检测PV患者血浆中40个细胞因子(Cytokines, CK)的表达情况,筛选其与正常人血浆中差异性表达的CK。同时研究竹黄颗粒治疗PV的临床疗效以及对差异性rniRNAs和CK表达的干预作用,探讨miRNAs和CK在寻常型银屑病中的作用机制,探索中医药治疗银屑病的作用新靶点,为中医药防治银屑病提供新的理论和实验依据。方法:1.采集5例PV患者和5例健康志愿者PBMCs后,用Trizol法提取RNA,运用Affymetrix miRNA2.0芯片检测PV患者和正常人PBMCs中miRNAs6勺表达谱系,运用聚类分析软件(cluster3.0)分析差异性表达的miRNAs。2.采集20例PV患者和10例健康志愿者PBMC,运用RT-qPCR方法对部分差异性miRNAs进行验证。3.采集25例PV患者和15例健康志愿者血浆,运用Raybiotech定量双抗体夹心蛋白芯片(QAH-INF-3-2)技术检测40个CK的表达情况,运用聚类分析软件(cluster3.0)分析差异表达的CK。4.对25例PV患者应用竹黄颗粒治疗8周,采集患者治疗前后的PBMCs和血浆,运用RT-qPCR技术检测部分差异性miRNAs,运用Raybiotech定量双抗体夹心蛋白芯片(QAH-INF-3-2)技术检测差异性CK。探讨差异性miRNAs和CK与PV病情程度的相关性,分析竹黄颗粒对差异性miRNAs和CK的干预作用。结果:1.PV患者PBMCs中有39个miRNA呈差异性表达,其中miRNA-146a、miRNA-31、miRNA-192-5p、miRNA-21和miRNA-155等26个明显上调(q<0.05),miRNA-99a、miRNA-200c、miRNA-125b、 miRNA-1224-5p和miRNA-617等13个明显下调(q<0.05)。2与正常人比较,PV患者PBMCs中miRNA-146a、miRNA-31、 miRNA-192-5p表达均上调,差异均有显著性意义(p<0.05),miRNA-99a、miRNA-200c表达均下调,差异均有显著性意义(p<0.05),与miRNA基因芯片结果一致。3.与正常人比较,PV患者血浆中有26个细胞因子呈差异性表达,其中MIG、MCP-1、MIP-1β、 TNFβ、TNF sRI和TNF sRⅡ等18个表达明显上调(q<0.05), Eotaxin、PDGF-BB、RANTES和IL-6sR等8个表达明显下调(q<0.05)。4.竹黄颗粒治疗PV患者8周后,PASI积分明显下降,与治疗前比较差异有显著性意义(p<0.05),临床总有效率为80%。治疗结束后对5个差异性miRNAs表达情况与治疗前进行比较,miRNA-146a表达下调,miRNA-99a表达上调,差异有显著性意义(p<0.05)。治疗结束后对26个差异性细胞因子表达情况与治疗前进行比较,PDGF-BB和RANTES表达上调,TNF-α、MIP-1δ.TNF sRⅡ和ICAM-1表达下调,差异有显著性意义(q<0.05)。5.miRNA-146a表达水平与PASI呈正相关(p<0.05),miRNA-99a表达水平与PASI呈负相关(p<0.05)。PDGF-BB水平与PASI呈负相关(p<0.05),TNF-α、MIP-1δ和ICAM-1水平与PASI呈正相关(p<0.05)。结论:1.PV患者PBMCs中miRNA-146a、miRNA-31、miRNA-192-5p等26个miRNAs表达上调,miRNA-99a和miRNA-200c等13个miRNAs表达下调。39个差异性miRNAs可能在银屑病的发病机制中占有重要地位。2.PV患者血浆中TNF-a、ICAM-1和MIP-1δ等18个细胞因子水平表达上调,PDGF-BB和RANTES等8个细胞因子水平表达下调。细胞因子网络在银屑病的发病机制中有重要意义。3.miRNA-146a、miRNA-99a、PDGF-BB、TNF-α、MIP-1δ和ICAM-1水平与PV皮损症状严重程度密切相关,可以作为判断病情和临床疗效的生物学指标之一。4.竹黄颗粒治疗PV疗效显著,它可能是通过双向调节miRNA-146a、miRNA-99a和TNFα、MIP-1δ、TNF sRⅡ ICAM-1PDGF-BB、RANTES等细胞因子的表达水平而发挥作用机制。
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