论文部分内容阅读
肿瘤是引起人类死亡率持续攀升的元凶之一,肿瘤的增殖与转移主要凭借肿瘤血管来供应必要的氧气与营养,血管缺乏的肿瘤具有自限性生长的特点。如今,众多的抗血管药物已被开发出来用于阻断外界营养供给实现肿瘤饥饿治疗,但此药物发挥效用后,肿瘤细胞会通过自噬增强效应为自身增殖提供内源性营养物质,从而进行自我保护导致抗肿瘤效果严重下降。破坏肿瘤血管系统的同时抑制增强的自噬,对肿瘤的外源性与内源性营养来源进行双重阻断,将会是一种有前途的抗肿瘤方法。因此,本课题以海藻酸钠(Sodium alginate,Alg)为基质材料,Fe3+为交联剂与门控开关,康普瑞汀(Combretastatin A4,CA4)及硫酸羟基氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)为治疗药物,构建了一种具有定位重塑功能的智能纳米凝胶CA4-FeAlg/HCQ,用于共递送血管阻断剂CA4与自噬抑制剂HCQ,实现CA4在肿瘤血管和HCQ在肿瘤细胞中的贯序释放,以及对A549非小细胞肺癌的协同治疗。本课题首先将血管阻断剂CA4接枝到Alg上,合成接枝率为14%的Alg-CA4偶联物,提高CA4的生物利用度与稳定性。然后与Fe3+自组装形成CA4-FeAlg纳米凝胶,在纳米凝胶内部负载自噬抑制剂HCQ,得到用于肿瘤协同治疗的CA4-FeAlg/HCQ。实验结果显示,CA4-FeAlg纳米凝胶的水合粒径约为150nm。在体外模拟肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)条件下,Fe3+被还原为Fe2+,发生由凝胶到溶胶的相重构,纳米凝胶自外而内进行解离,其粒径降低(≤ 27 nm),表明纳米凝胶具有TME响应性粒径转化(由大变小)特性,有利于肿瘤的深部渗透。CA4-FeAlg的三维网状结构可有效荷载HCQ,包封率与载药率分别为13.8%和21.6%。CA4-FeAlg/HCQ的释药结果表明,CA4和HCQ的释药行为存在显著差异。CA4-FeAlg/HCQ在pH 7.4+10%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)的介质中(模拟血液循环)稳定存在,而在pH 7.4的介质中(模拟肿瘤血管处环境)可快速释放CA4,HCQ则在pH 5.5+5 mM谷胱甘肽(Glutathione,GSH)介质中(模拟肿瘤细胞微环境)快速释放。上述结果证明CA4-FeAlg/HCQ纳米凝胶可在肿瘤血管和肿瘤细胞两个作用靶点依次定点释放CA4和HCQ,这为纳米共递送平台的联合用药提供了一种新思路。体外细胞摄取及分布结果显示,FeAlg可在4 h内被A549肺癌细胞大量摄取,摄取量达到84%,进入细胞后,FeAlg主要分布于溶酶体,3 h时平均共定位系数为0.74±0.09,表明FeAlg可携带HCQ快速进入肿瘤细胞并定位于溶酶体。在肿瘤细胞中,FeAlg能够通过芬顿反应高效歧化H2O2产生·OH。生成的·OH与释放的HCQ共同作用于溶酶体,造成溶酶体损伤,阻碍自噬溶酶体的形成与降解,从而发挥自噬抑制作用,协同促进CA4的抗肿瘤效果。免疫组化和ELISA结果表明,CA4-FeAlg/HCQ能够显著抑制肿瘤细胞的自噬,与其它实验组相比,呈现显著性差异。体外肿瘤细胞球渗透结果显示,与粒径稳定的介孔SiO2组相比,具有粒径转化特性的FeAlg纳米凝胶渗透深度可增加约2倍。体外细胞毒性结果表明CA4-FeAlg/HCQ(20μg/mL)作用48h后,细胞抑制率达到93.86%,可有效杀伤A549肿瘤细胞。Calcein-AM/PI双染实验亦表明CA4-FeAlg/HCQ作用后的细胞活性最低。体内实验以A549荷瘤裸鼠为动物模型。光学活体成像结果揭示CA4-FeAlg/HCQ可以快速蓄积于肿瘤部位并长效滞留。而且,CA4-FeAlg/HCQ响应TME的粒径转换特性,使其具有非常优秀的肿瘤深部穿透性。药效学实验显示,CA4-FeAlg/HCQ的体内治疗效果最佳,相对肿瘤体积最终可下降至0.40±0.10,与CA4-FeAlg组存在显著性差异。免疫荧光结果表明,CA4-FeAlg可显著降低肿瘤血管的密度,从而阻断肿瘤增殖的营养通道,诱发肿瘤细胞死亡。活性氧检测结果显示,FeAlg可以歧化瘤内H2O2产生·OH,进一步杀死肿瘤细胞。免疫组化与TEM均表明CA4-FeAlg/HCQ能够有效抑制CA4-FeAlg抗血管治疗诱导的自噬,从而实现肿瘤的协同治疗。