背景课题组前期研究结果显示抗菌肽Merecidin能够抑制临床分离菌株铜绿假单胞菌PA03形成的生物被膜,并对抗菌肽Merecidin作用前后PA03形成的生物被膜进行了原核转录组测序分析。目的通过分析抗菌肽Merecidin作用前后PA03形成的生物被膜转录组测序结果,筛选差异表达基因,以期找到抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌PA03生物被膜的相关作用机制。方法1.根据抗菌肽Merecidin处理前、后PA03形成的生物被膜原核转录组测序分析的结果,筛选目的基因。2.根据第一部分筛选到的结果,PCR扩增PA03菌株中的PA4781基因,插入p MP2444载体,构建PA4781过表达载体,电转化进入PA03感受态细胞,构建PA4781过表达菌株,菌落PCR验证其正确性。根据PA4781基因序列设计3个靶点sg RNA,使用pn Cas PA-BEC系统,以期在靶点处出现预期的碱基突变从而产生终止密码子,提前终止PA4781的转录,从而达到敲除PA4781基因的目的,Sanger测序方法检测敲除的正确性。3.结晶紫染色法定量观察24h时PA03菌株,PA4781过表达菌株,PA4781敲除菌株生物被膜生长情况以及在抗菌肽Merecidin作用下各菌株生物被膜的生长情况。采用对羟基联苯溶液显色法检测在抗菌肽Merecidin作用下各菌株生物被膜藻酸盐的变化情况。采用HPLC检测在抗菌肽Merecidin作用下各菌株生物被膜c-di-GMP含量。通过扫描电镜(SEM)观察抗菌肽Merecidin作用下各菌株生物被膜的显微变化情况。将受试菌置于swimming、swarming运动平板观察各菌株运动能力变化情况。盐酸氯仿萃取后检测光密度值检定受试菌绿脓菌素的表达情况。结果1.经分析筛选并用Real time PCR验证,PA4781基因在抗菌肽Merecidin12、24、48μmol/L作用下其基因表达分别为对照组PA03的2.8、3.3、3.9倍。将PA4781基因作为本研究的靶基因进行后续的实验研究。PA4781作为细菌第二信使分子环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)的磷酸二酯酶具有降解c-di-GMP的作用。2.PCR筛选及Sanger测序结果证明PA4781过表达,敲除菌株构建成功。3.(1)结晶紫染色结果显示,培养24h时,在24μmol/L抗菌肽Merecidin作用下,PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株这3株菌生物被膜形成情况无显著性差异(P>0.05),在抗菌肽Merecidin48、72μmol/L处理下,过表达株与正常株和敲除株有显著性差异(P<0.05),生物被膜明显减少,敲除株生物被膜厚度高于PA03组(P<0.05)。(2)随着抗菌肽Merecidin浓度增加各组藻酸盐含量下降,其中过表达菌株在抗菌肽Merecidin作用下藻酸盐生成量抑制率最高,可达65%。(3)PA4781敲除株c-di-GMP含量高于PA03及PA4781过表达菌株(P<0.05)。抗菌肽Merecidin处理后PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜c-di-GMP含量均下降其中PA4781过表达菌株下降程度最大,当用抗菌肽Merecidin 72μmol/L处理时,过表达菌株c-di-GMP的含量仅为不加药时生成量的37.2%,而敲除株pn Cas PABEC-ΔPA4781的c-di-GMP含量是未加药时的66.9%,PA03菌株的c-di-GMP含量是未加药时是58.8%。(4)扫描电镜观察各菌株生物被膜显微变化情况,发现抗菌肽Merecidin处理后过表达菌株生物被膜形态破坏程度最为明显,且菌体受损最为严重。(5)通过对于各菌株运动能力的观察发现,抗菌肽Merecidin能够抑制各菌株运动能力,其中过表达菌株效果最明显,抗菌肽Merecidin 72μmol/L处理后过表达菌株已丧失运动能力。(6)抗菌肽Merecidin作用下绿脓菌素被明显抑制。结论1.根据抗菌肽Merecidin作用前后原核转录组测序分析,显示影响抗菌肽作用生物被膜的相关通路有很多,本实验中筛选出的靶基因PA4781提示抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌PA03生物被膜可能与细菌第二信使分子c-di-GMP有关。2.抗菌肽Merecidin通过上调PA4781基因表达,增强其降解细菌第二信使分子c-diGMP的作用,从而放大c-di-GMP系统在抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的影响。而且抗菌肽Merecidin还可能通过抑制细菌运动,及毒力因子绿脓菌素的产生,影响生物被膜的形成。