研究背景乳腺癌是全球年轻人发病率和死亡率最高的癌症类型,寻找乳腺癌治疗新靶点,研发特异性药物,是乳腺癌治疗亟待解决的问题。血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)是侵袭性乳腺癌表型的标志,是高侵袭性的肿瘤细胞自身围成的一种高度模式化和功能性管状结构,在肿瘤进展的各个阶段支持肿瘤生长和转移。VM形成过程中有许多因素是必需的,包括肿瘤缺氧微环境。缺氧微环境下,缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factors,HIF-lα)被认为是VM信号传导中的“启动开关”,它可以直接或间接调节VE-Cadherin的表达并激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)级联反应。最后,通过基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)的表达和激活,收缩基质进入细胞外微环境形成VM。但是,肿瘤细胞如何感知细胞外缺氧微环境的尚不清楚。HIF-lα虽然是对缺氧反应的执行者,但它本身并不直接感应氧气张力(p02)的变化,而是受脯氨酰4-羟化酶2(Prolyl-4-hydroxylases2,PHD2)的调节。PHD2的羟基化能调节HIF-1α的稳定性和转录活性。在常氧条件下,PHD2催化氧原子和HIF-lα上脯氨酸的一个氢原子结合形成羟基,这是HIF-1α泛素化降解的关键。缺氧时,由于02限制,抑制PHD2对HIF-1α的羟化,HIF-1α降解减少,然后不断积累、入核,与HIF-1β组成异源二聚体HIF-1,激活缺氧信号通路。这意味着PHD2对HIF-1α的准确调节对于癌症的发生发展至关重要。蛋白质的可逆磷酸化被认为是蛋白质翻译后调控的一种常见方式。蛋白磷酸酶2A(Proteinphosphatase2A,PP2A)是一种广泛存在于真核生物中的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。PP2A通过触发蛋白质的去磷酸化来调节肿瘤细胞的氧化代谢、侵袭转移过程。目前PHD2的蛋白质结构已经被揭示,其核转运序列上存在去磷酸化位点,可以被磷酸酶去磷酸化。有文献报道,PP2A/B55可以使PHD2去磷酸化,导致PHD2部分失活,但关于PP2A和PHD2对乳腺癌侵袭转移的分子机制还不清楚。尤其是在缺氧的微环境下,PP2A如何通过PHD2进而影响乳腺癌的血管生成拟态的研究未见报道。我们课题组先前的研究发现,海藻糖衍生物DMBT可以抑制缺氧环境下人乳腺癌细胞的VM形成及侵袭迁移能力,但具体的作用机制及PP2A/PHD2/HIF-1α在其中的作用,还有待进一步探讨。本课题主要从体外和体内水平探讨PP2A在缺氧的微环境下如何通过影响PHD2和HIF-1α调控乳腺癌VM的形成,进而影响乳腺癌的增殖和迁移,明确细胞缺氧信号通路的传导和VM在乳腺肿瘤中的调控机制,可以有效的抑制乳腺肿瘤细胞的侵袭转移过程。另外,通过考察海藻衍生物DMBT与PP2A的相互作用,进一步研究DMBT抗乳腺癌侵袭转移的作用机制及是否与PP2A/PHD2/HIF-1α信号轴有关,明确DMBT的作用靶点,为开发选择性高的特异性药物提供了理论支持。实验方法和结果1.体外实验缺氧造模:利用CoCl2处理和1%O2培养两种方式模拟乳腺癌细胞体外缺氧微环境,MTT检测细胞生存率,Western blotting检测缺氧相关蛋白HIF-lα和PHD2 的表达,选定 400 μmol/L CoCl2 处理 24 h,1%O2 培养 24 h 营造 MDA-MB-231和MCF-7细胞体外缺氧模型。PP2A对乳腺癌细胞侵袭迁移的影响:MTT检测PP2A诱导剂FTY720和PP2A抑制剂OA对MDA-MB-231和MCF-7细胞生存率的影响,选择不影响细胞生存率的低浓度FTY720(2μmol/L)和OA(10nmol/L)进行划痕实验。划痕实验、Transwell侵袭实验和黏附实验考察缺氧环境下PP2A对MDA-MB-231和MCF-7细胞迁移、侵袭和黏附的影响。结果显示PP2A诱导剂FTY720或者Ad-PP2A促进MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移、侵袭和黏附,PP2A抑制剂OA和Ad-dn-PP2A则抑制其迁移、侵袭和黏附。PP2A对乳腺癌细胞VM的影响:VM形成实验考察缺氧环境下Ad-PP2A/Ad-dn-PP2A对MDA-MB-231细胞VM形成的影响。Western blotting检测缺氧环境下,Ad-PP2A/Ad-dn-PP2A 转染对 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞 VM 相关蛋白PI3K、AKT、P-AKT、VE-Cadherin、MMP-2表达的影响。结果发现缺氧环境下,Ad-PP2A促进乳腺癌细胞VM形成和VM相关蛋白的表达,而Ad-dn-PP2A则抑制了 VM形成和VM相关蛋白的表达。PP2A影响乳腺癌细胞VM形成和侵袭转移的机制:Western blotting检测在常氧和缺氧环境下,经腺病毒转染后HIF-1α的积累量,结果发现无论是常氧还是缺氧环境下,Ad-PP2A组的HIF-1α积累量均增加,而Ad-dn-PP2A组则降低了 HIF-lα的量。PP2A酶活检测结果发现,缺氧环境下PP2A的活性较常氧环境下增强57.47%,这提示乳腺癌细胞在缺氧环境下侵袭迁移等能力的变化可能与PP2A密切相关。Western blotting检测缺氧环境下PP2A对PHD2表达的影响,结果发现,缺氧环境下,PHD2表达下调,Ad-PP2A进一步抑制了 PHD2的表达,而Ad-dn-PP2A则上调了缺氧环境下PHD2的表达。接下来,经PHD2的抑制剂DMOG处理,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力,发现DMOG逆转了 Ad-dn-PP2A对MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用,迁移促进率达18.06%。Western blotting 检测 HIF-1α,PHD2,OH-HIF-1α 的表达,发现 DMOG 确实逆转了 Ad-dn-PP2A的作用,使Ad-dn-PP2A组的OH-HIF-1α表达下调,HIF-1α表达上调,证明了 PP2A的作用与PHD2有关。随后通过免疫荧光染色及DAPI标示细胞核,检测到与LacZ组相比,缺氧+LacZ(Hypoxia+LacZ)组的PHD2明显更多地分布在细胞核,Ad-PP2A进一步促进了 PHD2在细胞核的分布,而Ad-dn-PP2A组的PHD2则重新定位于细胞质。接下来,进一步探究DMBT抑制缺氧微环境中乳腺癌细胞侵袭转移和VM形成的作用机制。采用计算机分子对接实验,结果显示DMBT可以与PP2A催化亚基的活性位点Mn2+结合。PP2A磷酸酶活性检测显示DMBT显著降低了缺氧环境下PP2A的酶活性。VM形成实验检测LacZ组、Hypoxia+LacZ组、Hypoxia+LacZ+DMBT 组、Hypoxia+Ad-PP2A+DMBT 组、Hypoxia+Ad-dn-PP2A+DMBT组对VM形成的作用,结果显示在缺氧环境下,DMBT能有效抑制VM形成,同时DMBT与Ad-dn-PP2A有协同效应,而Ad-PP2A可逆转DMBT对VM的抑制形成;Western blotting实验检测VM相关蛋白P13K、AKT、P-AKT、MAPK、P-MAPK、mTOR、VE-Cadherin、MMP-2 的表达情况,结果显示Hypoxia+LacZ+DMBT 组显著下调 P-AKT、P-MAPK、mTOR、PI3K、MMP-2、VE-cadherin 的表达,同时 DMBT 与 Ad-dn-PP2A 有协同效应,Hypoxia+Ad-dn-PP2A+DMBT 组进一步下调 P-AKT、P-MAPK、mTOR、PI3K、MMP-2、VE-cadherin的表达,而Hypoxia+Ad-PP2A+DMBT组则逆转了 DMBT的作用,上调P-AKT、P-MAPK、mTOR、MMP-2、VE-cadherin的表达。免疫荧光染色检测到DMBT与PP2A低表达具有协同作用,使PHD2重新定位于细胞质,而PP2A高表达则逆转了 DMBT的作用,使PHD2更多地分布于细胞核中。2.体内试验18～22g(5～6周龄)的雌性BALB/c-nu裸鼠尾静脉接种经LacZ,Ad-PP2A或者Ad-dn-PP2A转染后的MDA-MB-231-luc-D3H2LN细胞,构建裸鼠实验性肺转移模型,连续给药20天,记录体重和生存期。小动物活体成像观察Control组、LacZ 组、Hypoxia+LacZ、Hypoxia+Ad-PP2A 组、Hypoxia+Ad-dn-PP2A 组、Hypoxia+LacZ+DMBT 组、Hypoxia+Ad-PP2A+DMBT 组、Hypoxia+Ad-dn-PP2A+DMBT肿瘤细胞转移的情况。CD34/PAS双染法观察各组体内VM形成。解剖肺组织观察肺转移结节。结果显示,与Control组相比,腺病毒空载体转染组(LacZ)的肺部生物发光强度略有下降,但没有显著性差异。说明腺病毒载体对实验结果影响较小。与缺氧组(Hypoxia+LacZ)相比,Hypoxia+Ad-PP2A组肺部生物发光强度增强,肺转移结节增多,生存期较短,肺组织有较多的VM通道,体重也明显降低,Hypoxia+Ad-dn-PP2A组减弱,肺转移结节较少,生存期较长,肺组织很难发现VM的存在,管道稀少细小。另外,与Hypoxia+LacZ组相比,Hypoxia+LacZ+DMBT可以抑制乳腺癌细胞肺部生物发光强度,减少肺部转移结节,Ad-dn-PP2A与DMBT具有协同作用,而Ad-PP2A则逆转了 DMBT的作用,肺部生物发光强度增加,肺转移结节增多。实验结论1.缺氧环境下,在体内和体外实验中,PP2A过表达均促进了乳腺癌细胞VM的形成和侵袭转移。2.MDA-MB-231和MCF-7细胞感受缺氧微环境,开始于PP2A活性的上调,这增加了 PHD2的去磷酸化,并促进了 PHD2转运进核,PHD2和HIF-1α核质空间上的阻隔,降低了HIF-1α的羟化和降解,导致HIF-1α积聚增多,启动VE-Cadheren/P13K/AKT/MMPs信号通路,促进了乳腺癌细胞的VM形成,进而影响其侵袭转移。3.DMBT可以和PP2A的活性位点结合,并在缺氧环境下降低PP2A的酶活性,低表达PP2A与DMBT协同抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞中的VM形成,而高表达PP2A与DMBT具有拮抗作用,即PP2A可能是DMBT下调HIF-1α的关键因子,DMBT可能是通过PP2A/PHD2信号轴下调缺氧环境中的HIF-1α,从而减少HIF-1α下游VM相关蛋白表达,抑制乳腺癌细胞VM形成和侵袭转移。研究意义本课题探讨了 PP2A在缺氧的微环境下如何通过影响PHD2和HIF-1α调控乳腺癌VM的形成,进而影响乳腺肿瘤的增殖和迁移的作用及作用机制,并探究了 DMBT通过PP2A/PHD2/HIF-1α信号轴的干预作用及机制,明确VM在乳腺癌中的调控机制,将为乳腺癌抗侵袭转移治疗和开发抗癌药物提供更好的理论和实践支持。