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本文从微生物纤溶酶和纳米银的制备,以及其抗栓抗菌复合系统的构建等方面开展应用基础研究。首先,通过纤溶活性筛选法获得一株纤溶酶高产菌株-解淀粉芽胞杆菌LSSE-62。在34℃和50%初始含水量条件下发酵鹰嘴豆,纤溶活性达39.28FU/g干重,经硫酸铵沉淀获得高活性冻干粉(3569.68FU/g)。发酵后,鹰嘴豆的总酚、总黄酮含量和抗氧化活性得到提高,并具有强大的抗凝活性和丰富的营养成分。
其次,通过基因扩增法筛选到一株高产纳豆激酶纤溶酶(NK)的枯草芽胞杆菌,发酵鹰嘴豆的NK活性达356.25FU/g,副产物聚谷氨酸含量较低。发酵的鹰嘴豆经50%乙醇萃取和75%乙醇沉淀,NK活性回收率达89%,聚谷氨酸回收率降至21%,获得高活性冻干粉(4000.58FU/g)。通过甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯聚合物包衣技术制备了NK肠溶胶囊,实现了NK的抗酸保护和肠道控制释放。
为开发NK在抗栓抗菌复合系统中的应用,首次通过阳光诱导不同生物介质高效制备了4种纳米银。通过阳光诱导解淀粉芽胞杆菌细胞抽提物合成纳米银(E-Ag)。在光强度70,0001x、抽提物3mg/mL、NaCl2mM的条件下,80min可完成1mMAg+的还原形成E-Ag。E-Ag主要是平均粒径为14.6nm的球形银单质纳米晶,Zeta电位达-70.84mV,抗菌性能良好。根据红外分析推测其反应机理为:蛋白肽类分子螯合Ag+,光驱动下发生还原反应形成稳定的纳米分散体系。相比E-Ag,解淀粉芽胞杆菌发酵上清液合成的纳米银(S-Ag)平均粒径增大,稳定性降低,且反应速率降低。另外,通过胰蛋白胨和酵母抽提物合成两种纳米银(T-Ag和Y-Ag),胰蛋白胨可在60min内还原1mMAg+形成T-Ag。T-Ag和Y-Ag均为螯合蛋白肽类分子的球形单质银纳米晶,抗菌性能良好,酸性pH和长期阳光照射可显著降低其稳定性。
最后,通过T-Ag吸附NK制备了纳豆激酶-纳米银抗栓抗菌复合颗粒(NK-Ag),T-Ag对NK的饱和吸附量高达24.35FU/mg,NK-Ag还增强了NK的热稳定性和抗凝活性。在静电作用力驱动下,NK-Ag与聚乙烯亚胺(PEI)层层自组装成规则、均匀的NK-Ag-PEI复合膜,具有良好的抗栓活性和抗菌活性。