活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一类化学性质相当活跃的氧的单电子还原产物，主要包括单线态氧，过氧化氢(H2O2)，超氧化物阴离子及羟自由基等活性分子，其中过H2O2是最重要的一种。机体ROS的产生增加和(或)清除ROS的能力降低时，ROS水平急剧升高可导致细胞显著损伤，这种ROS积聚的状态就是氧化应激。一般来说，ROS通过细胞膜脂质过氧化，抑制蛋白质功能，破坏核酸和染色体等方式损伤细胞。ROS也可作为关键的细胞内信号调节因子，参与对抗细胞损伤的存活机制，介导氧化应激预处理的保护作用，参与细胞的增殖，迁移和分化。因此，对ROS在氧化应激中的损伤与保护机制的深入研究，有利于改善损伤组织的微环境，有利于提高移植细胞的存活率，有利于提高细胞移植治疗的效率。 骨髓间质干细胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，可分化成各种类型的细胞，且具有扩增快捷、取材方便、无排异反应等优点，已被极大的关注。在治疗以细胞损伤或丢失为特征的疾病具有较好的治疗性作用，如在治疗外伤性脑损伤、脊髓损伤、中风和急性心肌梗死等疾病取得令人鼓舞的结果。 虽然BMSCs移植治疗已取得一些进展，但由于BMSCs在损伤区的存活率低，极大的限制了它的应用，且凋亡被认为是最主要的死亡方式。另外，静脉注射移植的BMSCs必需到达细胞损伤或丢失处才能发挥其作用，迁移到达损伤处BMSCs的数量决定治疗效果。SDF-1/CXCR4轴在BMSCs迁移中起重要作用，同时也调节细胞的存活和生长。本试验通过观察不同浓度H2O2对BMSCs活性及迁移的影响，探讨氧化应激预处理对BMSCs的适应性保护作用和促进其迁移的机制，为BMSCs的移植治疗提供实验理论基础。 一、氧化应激预处理对BMSCs的适应性保护作用 研究目的： 探讨氧化应激对BMSCs抗氧化应激损伤的适应性保护作用及机制 研究方法： 1.BMSCs表面抗原表达的测定 2.MTT法检测BMSCs活性 3.Hochest染色检测BMSCs凋亡 4.流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)检测BMSCs凋亡 5.逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription—polymerase chain raction，RT—PCR)检测Caspase—3、BCL—2 mRNA水平的变化 研究结果： 1.BMSCs的表型分析 BMSCs表型为CD29，CD44阳性，而CD106、CD166、CD71、CD34为阴性；CD45的表达则不稳定，部分标本呈阳性，部分则呈阴性。 2.不同浓度H2O2作用24h对BMSCs凋亡的影响： 对照组的凋亡率为(2.25±0.26)：20，50μmol/L H2O2作用BMSCs24h组凋亡率分别为(2.29±0.51)％，(3.23±0.67)％，与对照组比较无明显差异(P>0.01)。100、200、300、400、500μmol/L H2O2作用BMSCs24h，凋亡率分别为(7.31±1.23)％，(12.93±1.57)％，(31.27±2.44)％，(44.17±3.16)％和(65.39±4.64)％，与对照组比较凋亡率明显增加(P<0.01)。此结果表明：20、50μmol/L H2O2几乎不引起BMSCs的凋亡；100-500μmol/L H2O2，且呈浓度依赖性引起BMSCs凋亡，其中500μmol/L H2O2引起50％以上的BMSCs凋亡。 3.不同浓度H2O2预处理对BMSCs活性的影响 MTT活性检测：20，50，100μmol/L H2O2预处理BMSCs24h活性分别为(277.62±5.21)％，(191.98±4.49)％，(66.53±3.37)％，20μmol/L H2O2预处理组与其他各组比较活性显著增加(P＜0.05)。20μmol/L H2O2预处理BMSCs24h BMSCs活性明显高于其他各组，因此我们选择确定20μmol/L H2O2为预处理浓度。 4.H2O2预处理不同时间间隔对BMSCs活性的影响： MTT活性检测：20μmol/L H2O2处理BMSCs24h后间隔6，12，24h，各组活性分别为(110.85±4.21)％，(187.38±7.49)％，(106.91±3.37)％。结果表明：20μmol/L H2O2处理BMSCs24h后间隔12h组细胞活性明显高于其他各组(P＜0.05)，因此选择预处理的时间间隔为12h。 5.H2O2预处理对BMSCs氧化应激损伤的适应性保护作用: 实验分为三组：A组：对照组，B组：20μmol/L H2O2预处理24h，恢复12h，500μmol/L H2O2刺激24h组，C组：500μmol/L H2O2处理24h组。 (1) Hochest荧光染色后，在荧光显微镜下观察到，A组：BMSCs染色质分布均匀，为弥漫均匀的低强度荧光；B组：少量BMSCs的胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光；C组大量BMSCs的胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光。 (2) FCM定量检测H2O2预处理对BMSCs的保护作用，结果表明：B组的凋亡率分别为，(25.32±1.49)％与C组(65.39±4.64)％比较显著降低(P＜0.05)，说明20μmol/L的H2O2预处理能够减少500μmol/L的H2O2诱导的凋亡。 (3) RT—PCR检测Caspase—3、Bcl—2 mRNA水平的变化 A、B、C三组，Bcl—2在mRNA水平上的相对表达量分别是0.501±0.021，0.778±0.024，0.385±0.028；Caspase—3在mRNA水平上的相对光密度比值分别是0.354±0.026，0.443±0.031，0.612±0.039。结果表明：B组Bcl—2mRNA表达明显增加(与A、C组比较P＜0.05)，Caspase—3 mRNA表达明显减少(与C组比较P＜0.05)；C组Bcl—2mRNA表达明显减少，Caspase—3 mRNA表达明显增加(与A、B组比较，P＜0.05)。 结论：低浓度H2O2不引起BMSCs的凋亡，且低浓度H2O2预处理对高浓度H2O2引起的BMSCs凋亡具有适应性保护作用，其机制可能与H2O2预处理使BMSCs Bcl—2mRNA表达增加和Caspase—3mRNA表达降低有关。 二氧化应激预处理增加骨髓间质干细胞迁移能力的作用机制 研究目的： 探讨氧化应激预处理对BMSCs迁移能力的影响，阐明ERK信号通路在氧化应激预处理上调BMSCs表面CXCR4的作用机制。 研究方法： 1 FCM定量分析BMSCs表面CXCR4蛋白的表达变化 2 RT—PCR、荧光定量PCR检测CXCR4基因的表达变化 3 Western blot分析P—ERK1/2的变化 4迁移实验定量分析BMSCs迁移能力的变化 研究结果： 1.FCM分析结果表明20μmol/LH2O2处理BMSCs24h组CXCR4的表达率为(27.53±3.01)％与其他各组比较明显增加(P<0.05)，说明H2O2预处理能明显上调BMSCs表明CXCR4蛋白的表达。 2.荧光定量PCR结果表示20μmol/L H2O2处理BMSCs24h，CXCR4 mRNA的相对表达量为5.37±0.49，明显高于其他各组(P<0.05)。 3.Western blot结果表明在H2O2处理BMSCs20分钟时P—ERK1/2开始升高，持续至40分钟仍保持较高表达，60分钟时开始衰减。 4.BMSCs迁移能力的变化 H2O2预处理后能明显增加BMSCs向SDF-1的迁移能力，PD98059能阻断H2O2预处理增加的BMSCs迁移能力，但LY29004并不影响BMSCs迁移能力。 5.抑制剂对BMSCs表面CXCR4表达的影响 流式细胞仪结果：H2O2预处理组和H2O2预处理+PD98059组BMSCs表面CXCR4表达率分别为(27.53±3.01)％和(9.55±1.84)％，表明PD98059明显抑制H2O2预处理上调的BMSCs表面CXCR4蛋白表达。 结论：H2O2预处理能增加的BMSCs迁移能力，这种迁移能力的增加与ROS—ERK1/2-CXCR4信号通路有关。