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细胞的存活效应受到死亡信号和存活信号共同作用的调节。研究显示，NMDA受体在脑缺血-再灌注后谷氨酸诱导的兴奋性毒性效应中发挥关键作用。同时，神经生长因子(NGF)通过其高亲和力受体TrkA以及下游的信号通路介导多种细胞存活效应。NGF和NMDA受体都参与了脑缺血-再灌注后的病理生理过程。临床上针刺治疗脑缺血已取得较好疗效，本室以往的研究也显示，电针可以促进缺血损伤的海马和皮层细胞TrkA的表达，并抑制NMDAmRNA的过度表达，从而减少脑缺血诱导的神经元凋亡，发挥保护作用。本文在上述研究基础上，应用整体动物的脑缺血-再灌注模型，对NMDA受体和TrkA受体在针刺治疗脑缺血-再灌注损伤中的作用以及两者之间的相互关系进行进一步探讨，并在离体条件下应用缺糖缺氧(OGD)模型，以NGF模拟电针的效应，研究NGF对NMDA受体NR1亚单位基因转录调节的机制。
第一部分电针通过PI3-K通路调节局灶性脑缺血再灌注损伤区神经元NMDA受体NR1亚单位的表达
一、电针抑制缺血区大脑皮层NR1mRNA表达的异常升高
应用半定量RT-PCR方法分析了电针对缺血区大脑皮层NR1mRNA表达的影响。结果显示：缺血再灌注24h后，单纯缺血组大脑皮层NR1mRNA的水平明显升高，与正常组比较，有显著差异(P＜0.05)。比较正常组和正常+电针组的结果可以看出，电针对未缺血大鼠的NR1mRNA表达并无影响。对于缺血-再灌注后的大鼠，电针治疗可以显著的降低缺血区大脑皮层NR1mRNA的水平，与单纯缺血组和缺血+假电针组相比，都具有显著差异(P＜0.05)。这些结果表明电针治疗可以逆转缺血区大脑皮层NR1mRNA表达的异常升高。
二、电针治疗上调缺血区大脑皮层TrkA的表达
应用免疫荧光标记技术观察电针治疗对缺血区大脑皮层TrkA表达的影响。结果显示，在正常组和正常+电针组，大脑皮层内未见TrkA阳性神经元。缺血再灌注24h后，单纯缺血组和缺血+假电针组的大脑皮层内TrkA的表达量仍没有明显的升高。但是缺血-再灌注大鼠经过电针治疗后，其缺血区大脑皮层内TrkA阳性神经元数目明显增多。这些阳性神经元可见于缺血区大脑皮层锥体细胞层，呈绿色荧光，胞膜和胞浆均有着色。结果表明电针治疗可以上调缺血区大脑皮层TrkA的表达。
三、电针治疗后缺血区大脑皮层内TrkA和NR1的共存
应用免疫荧光双标技术在共聚焦激光显微镜下观察电针治疗后缺血区大脑皮层内TrkA和NR1的共存情况。结果显示，脑缺血-再灌注给与电针治疗后，在大鼠缺血区大脑皮层的锥体细胞层可观察到TrkA和NR1的双标产物：FITC标记的TrkA阳性细胞呈绿色荧光，TexasRed标记的NR1阳性细胞呈红色荧光，共聚焦激光显微镜下两者共表达的部分呈黄色。另外可见，TrkA主要表达于胞浆而NR1则主要表达在胞膜。这一结果说明TrkA和NR1在同一细胞上可能存在着“CrossTalk”。
四、电针通过PI3-K通路调节局灶性脑缺血再灌注损伤区神经元NMDA受体NR1亚单位的表达
应用半定量RT-PCR方法观察选用特异性抑制剂U0126和wortmannin分别阻断两种不同的信号通路后大脑皮层NR1mRNA表达的变化。结果显示，侧脑室注射了DMSO的单纯缺血组大鼠，其缺血区大脑皮层内NR1mRNA呈较高水平的表达，与此相比较，给与wortmannin或U0126侧脑室注射的单纯缺血组大鼠大脑皮层内NR1mRNA的表达没有明显的变化。在缺血+电针组内，电针将缺血区大脑皮层内NR1mRNA的表达调节到较低水平，但给与wortmannin处理的大鼠大脑皮层NR1mRNA量又显著增加，其增幅具有显著差异(P＜0.05)，而给与U0126处理的大鼠NR1mRNA仍处于较低表达水平。
应用形态学方法比较单纯缺血组和缺血+电针组大鼠缺血区大脑皮层内NR1阳性神经元的平均光密度。单纯缺血大脑皮层神经元内可见较强的NR1阳性染色，并且在wortmannin、U0126和空白对照各组之间没有明显的差异。但是，在电针治疗后，这种NR1强阳性染色明显的减弱。唯独在wortmannin处理组，电针治疗的效应被拮抗掉，缺血区大脑皮层内神经元仍呈较强的NR1阳性染色。
这些结果表明wortmannin抑制了电针治疗对NR1亚单位表达调节的神经保护效应，也证明了电针是通过PI3-K信号通路调节缺血-再灌注后NR1亚单位的表达。
第二部分NGF对缺糖缺氧海马神经元NMDA受体NR1亚单位表达的抑制作用及NRSF在其中的调节机制
一、NGF通过PI3-K通路降低OGD海马神经元的死亡率
以FDA标记存活细胞，PI标记死亡细胞，评价培养的海马神经元死亡率的变化。细胞计数结果如下：正常组神经元的死亡率处于较低的水平，2hOGD处理后，神经元死亡率明显上升，与正常对照组比较有显著差异(P＜0.05)。NGF处理后，OGD诱导的神经元死亡率明显降低，与OGD组比较，下降幅度具有显著差异性(P＜0.05)。在此基础上，给与特异性抑制剂处理，结果发现：OGD+NGF＋U0126组神经元死亡率与OGD+NGF组相比，无显著差异。而OGD+NGF+wortmannin组神经元死亡率明显增加，与OGD+NGF组相比，有显著性差异(P＜0.05)。这些结果表明，2hOGD处理可以较好的模拟整体状态下的脑缺血过程，而给与NGF处理后能有效减少OGD引起的神经元损伤，从而起到神经保护作用。Wortmannin可以阻断NGF的神经保护效应，说明NGF对OGD状态下神经元的保护作用由PI3-K通路所介导。
二、NGF通过PI3-K通路抑制OGD海马神经元NMDA受体NR1亚单位mRNA的过量表达
应用半定量RT-PCR方法检测OGD海马神经元NMDA受体NR1亚单位mRNA表达的变化，同时予以NGF和U0126、wortmannin两种不同抑制剂后观察它们对NR1mRNA表达的影响。结果显示，2hOGD处理后24h可以使培养细胞的NR1mRNA水平增加，与正常组比较有显著差异(P＜0.05)。给与NGF处理后能显著减弱OGD对NR1表达的诱导作用，NR1mRNA的表达水平回落至正常水平。在此基础上，给与抑制剂wortmannin阻断PI3-K通路后，培养细胞NR1mRNA水平明显升高，与OGD+NGF组相比，有显著差异(P＜0.05)；给与抑制剂U0126则没有这样的效果，培养细胞的NR1mRNA表达仍处于正常水平。
三、NGF通过PI3-K通路增加了OGD海马神经元内NRSF与NR1DNA的结合力
应用电泳迁移率变更分析(EMSA)检测NGF及其下游通路对OGD海马神经元内NRSF与NR1DNA结合力的影响。结果显示，在正常情况下，未见明显的滞后条带，这表明NR1/NRSE和NRSF的结合能力较弱。2hOGD处理后，可见一较浅的滞后条带；在此基础上，给与NGF处理，可见滞后条带明显增强。这些结果提示，NGF能显著增加NR1/NRSE和NRSF的结合能力。应用特异性拮抗剂wortmannin后，滞后条带明显减弱，表明NGF对NRSF的DNA结合力的增强作用被抑制，而给与拮抗剂U0126后，并未出现这样的抑制作用。这说明NGF可以通过PI3-K通路增强NRSF的DNA结合力。
结论：脑缺血-再灌注损伤后，电针治疗可以上调缺血区大脑皮层TrkA受体的表达，同时，也可以抑制缺血损伤诱导的NMDA受体NR1亚单位的异常表达。电针的神经保护效应由TrkA-PI3-K通路介导。通过该信号通路可以增强负性转录因子NRSF与NMDA受体NR1亚单位基因的结合能力，从而在转录水平上抑制NR1的表达。