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研究目的：本研究是以科技部“十一·五”“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”重大专项“慢性乙肝病毒携带者的证候规律及中医药治疗方案研究”课题为基础,对前期临床研究结果进行机制研究,研究分为体内试验和体外实验两个部分。(1)通过临床体内试验观察补肾健脾解毒方对慢性HBV携带者免疫耐受关键细胞CD4+CD25+Treg表达频率及功能,DC成熟缺陷及免疫功能指标的影响,以及细胞免疫功能指标的变化与血清HBV DNA、HBsAg定量变化的相关性,探讨补肾健脾解毒方抗HBV的作用与这些关键细胞及功能的关系。(2)通过药物血清体外实验研究,探索补肾健脾解毒方及其各组成治法在打破慢性HBV携带者免疫耐受状态的作用靶点和强度,以及各治法的协同效应,阐明该方抗HBV的免疫作用机制,从微观领域为中医药治疗该病立法组方及提高疗效提供思路和理论依据。研究方法：研究分成两个部分。实验第一部分：补肾健脾解毒方抗HBV作用与CD4+CD25+Treg、DC细胞及细胞免疫功能指标变化的相关性研究治疗组纳入30例符合诊断标准的慢性HBV携带者,采用补肾健脾解毒法中药复方干预,为期48周。(1)将基线水平慢性HBV携带者血清HBV DNA定量分三个层次,分别为：,61g-81gIU/ml及≥81gIU/ml,基线水平血清HBsAg定量分两个层次,分别为：≤51gIU/ml及>51gIU/ml,比较慢性HBV携带者CD4+CD25+Treg表达频率及功能(IL-10、TGF-β)、DC成熟表面标记物(HLA-DR、CD80、CD86和CD1α)表达水平及免疫功能指标(MLR、IL-12、IFN-γ)和细胞免疫功能指标(CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+)与不同基线水平HBV DNA定量、HBsAg定量的相关性。(2)补肾健脾解毒方干预后,将治疗后的慢性HBV携带者血清HBV DNA定量的变化值分两个层次,分别为：较基线水平(治疗前)下降≥11gIU/ml及<11gIU/ml,血清HBsAg定量的变化值分两个层次,分别为：较基线水平(治疗前)≥0.51gIU/ml及<0.51gIU/ml,比较慢性HBV携带者CD4+CD25+Treg表达频率及功能、DC成熟表面标记物表达水平及免疫功能指标和细胞免疫功能指标变化与血清HBV DNA、HBsAg变化的相关性。(3)观察不良反应的发生。实验第二部分：补肾健脾解毒方及各治法药物血清对慢性HBV携带免疫耐受状态CD4+CD25+Treg、DC细胞功能影响的研究将25只正常Wistar大鼠随机分成5组,每组5只,即生理盐水组、补肾健脾解毒方组、补肾组、健脾组,解毒组,制备补肾健脾解毒方及其组方各治法(补肾法、健脾法、解毒法)药物血清,用各药物血清体外干预慢性HBV携带者血清,观察：(1)各药物血清体外干预对CD4+CD25+Treg表达频率及功能(IL-10、TGF-β)的影响。(2)各药物血清体外干预对DC成熟表面标记物(HLA-DR、CD80、CD86和CD1 α)表达水平及免疫功能指标(MLR、IL-12、IFN-γ)的影响。研究结果：实验第一部分：(1) CD4+CD25+Treg、DC和细胞免疫功能相关指标与不同基线水平血清HBV DNA、 HBsAg定量的相关性将基线水平慢性HBV携带者血清HBV DNA定量分三个层次,分别为：≤61gIU/ml, 61g-81gIU/ml及≥81gIU/ml,三组血清HBV DNA定量与其相应的CD4+CD25+Treg表达频率及功能指标(IL-10、TGF-β)、DC成熟表面分子表达率(HLA-DR、CD86、CD80及CD1α)、DC免疫功能指标(MLR、IL-12及IFN-γ)、细胞免疫功能指标(CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+)相比较,相关性均无统计学意义(P>0.05)。将基线水平血清HBsAg定量分两个层次,分别为：≤51glU/ml及>51glU/ml,两组血清HBsAg定量与其相应的CD4+CD25+Treg表达频率及功能指标(IL-10、TGF-β)、DC成熟表面分子表达率(HLA-DR、CD86、CD80及CD1 a)、DC免疫功能指标(MLR、IL-12及IFN-γ)、细胞免疫功能指标(CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+)相比较,相关性均无统计学意义(P>0.05)。(2)补肾健脾解毒方降低血清HBV DNA、HBsAg水平与CD4+CD25+Treg、DC和细胞免疫功能相关指标的相关性将治疗后的慢性HBV携带者血清HBV DNA定量的变化值分两个层次,分别为：≥ 11glU/ml及<11gIU/ml,与其相应的治疗前后CD4+CD25+Treg表达频率及功能指标(IL-10、TGF-β)的变化值相比较,当血清HBV DNA下降≥11gIU/ml,与CD4+CD25+Treg功能指标IL-10的变化值相关性有显著意义(P<0.05)。与其相应的治疗前后DC成熟表面分子表达率(HLA-DR、CD86、CD80及CD1 α)的变化值相比较,相关性均无统计学意义(P>0.05)。与其相应的治疗前后DC免疫功能指标(MLR、IL-12及IFN-γ)的变化值相比较,相关性均无统计学意义(P>0.05)。与其相应的治疗前后细胞免疫功能指标(CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+)的变化值相比较,当血清HBV DNA下降≥11gIU/ml,与CD8+的变化值相关性有显著意义(P<0.05),其余各组相比较,相关性均无统计学意义(P>0.05)。将治疗后的血清HBsAg定量的变化值分两个层次,分别为：≥0.51gIU/ml及<0.51gIU/ml,与其相应的治疗前后CD4+CD25+Treg表达频率及功能指标(IL-10、TGF-β)的变化值相比较,相关性均无统计学意义(P>0.05)。与其相应的治疗前后DC成熟表面分子表达率(HLA-DR、CD86、CD80及CD1 α)的变化值相比较,当血清HBsAg下降≥0.51gIU/ml,与CD1 α的变化值相关性有显著意义(P<0.05),其余各组相比较,相关性均无统计学意义(P>0.05)。与其相应的治疗前后DC免疫功能指标(MLR、IL-12及IFN-γ)的变化值相比较,当血清HBsAg下降≥0.51gIU/ml,与IL-12的变化值相关性有显著意义(P<0.05)。与其相应的治疗前后细胞免疫功能指标(CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+)的变化值相比较,当血清HBsAg下降≥0.51gIU/ml,与CD8+的变化值相关性有显著意义(P<0.05),其余各组相比较,相关性均无统计学意义(P>0.05)。实验第二部分：(1)补肾健脾解毒方组、补肾组、健脾组和解毒组药物血清干预后,血清CD4+CD25+Treg表达频率分别为5.27%、6.32%、7.08%和19.34%；IL-10的含量水平分别为8.34pg/ml、12.08pg/ml、10.97pg/ml和17.27pg/ml; TGF-β的含量水平分别为237.45pg/ml、307.59pg/ml、264.32pg/ml和349.72pg/ml.除解毒组外其余三组CD4+CD25+Treg表达率、IL-10及TGF-β表达水平均明显下降,与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),其中以补肾健脾解毒方组下降最为明显(P<0.05)。(2)补肾健脾解毒方组、补肾组、健脾组和解毒组药物血清干预后,血清HLA-DR表达率分别为90.94%、89.45%、86.25%和83.28%,除解毒组外其余三组HLA-DR表达率均明显提高,与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),补肾健脾解毒方组提高最为明显(P<0.05)；CD86表达率分别为86.35%、85.29%、84.37%和79.62%,除解毒组外其余三组CD86表达率均明显提高,与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),补肾健脾解毒方组提高最为明显,但与补肾组和健脾组比较无明显差异(P>0.05)；CD80表达率分别为58.07%、55.69%、52.41%和50.21%,其中补肾组和补肾健脾解毒方组CD80表达率较生理盐水组明显提高,差异有统计学意义(P<9.05),补肾健脾解毒方组提高最为明显(P<0.05),解毒组和健脾组提高不明显,与生理盐水组比较无明显差异(P>0.05)；CD1 α表达率分别为48.87%、49.31%、45.87%和42.78%,其中补肾组和补肾健脾解毒方组CDl α表达率较生理盐水组明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),解毒组和健脾组提高不明显,与生理盐水组比较无明显差异(P>0.05)；DC诱导同种混合淋巴细胞反应(MLR)的能力分别为1.97、1.49、0.85和0.66,除解毒组外其余三组均明显上升,与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),其中以补肾健脾解毒方组提升最为明显(P<0.05)；MLR上清液中IFN-γ含量水平分别为59.4pg/ml、57.2pg/ml、50.6pg/m1和32.7pg/m1,除解毒组外其余三组均明显提高,与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),补肾健脾解毒方组提高最为明显(P<0.05)；MLR上清液中IL-12含量水平分别为288.7pg/ml、 285.4pg/ml、234.5pg/ml和220.4pg/ml,补肾组及补肾健脾解毒方组均明显提高,与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),以补肾健脾解毒方提高最为显著(P<0.05),健脾组和解毒组提高不明显,与生理盐水组比较无明显差异(P>0.05)。研究结论：实验第一部分：补肾健脾解毒方治疗慢性HBV携带的主要机制为：(1)能通过减少血清TGF-β、 IL-10的含量,从而下调CD4+CD25+Treg的表达频率,使CD4+CD25+Treg主导的免疫抑制作用减弱,进而激起HBV特异性免疫应答,抑制/清除乙肝病毒。经补肾健脾解毒方干预后,随着IL-10水平下降,机体对HBV DNA的清除能力增强,也表明当慢性HBV携带者天然免疫被激活后,CD4+CD25+Treg功能变化或许可以在一定程度上反映患者体内HBV DNA的清除情况。(2)可通过提高DC成熟表面分子(CD1 a)表达率,促进DC成熟,上调IL-12的表达水平,从而增强DC诱导MLR能力,进而增强DC的抗原递呈能力,而发挥清除乙肝表面抗原的作用。(3)能上调外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞的表达水平,降低CD8+T淋巴细胞的表达水平,导致CD4+/CD8+比值上调,进而调节细胞免疫功能,诱导病毒特异性CTL能力增强,进而抑制／清除乙肝病毒及乙肝表面抗原。经补肾健脾解毒方干预后,机体对HBV DNA、HBsAg的清除能力,随着CD8+T淋巴细胞水平下调而增强。实验第二部分：补肾健脾解毒方中补肾组和健脾组药物均能下调慢性HBV携带者血清CD4+CD25+Treg表达频率,二者作用相当：补肾组还可以促进DC成熟,从而增强其刺激淋巴细胞增殖的能力,健脾组不如补肾组明显；补肾组和健脾组具有协同作用,补肾组药物影响更强,能下调CD4+CD25+Treg表达、促进DC成熟及增强刺激淋巴细胞增殖的能力。提示在慢性HBV携带者的临床治疗中,补肾和健脾药物的应用,可能具有打破慢性HBV携带免疫耐受,降低血清HBV DNA载量的作用。