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新型H5亚型禽流感病毒(AIV)曾有感染人类的报道,常引起临床重症,导致高死亡率,对人类造成了巨大威胁。2014年,我国四川省出现全球首例H5N6亚型AIV人类死亡病例。由于目前在禽类中新型H5亚型AIV流行情况尚不清楚,对人类造成高死亡率机制不明,本文为此开展了以下3部分研究。第一部分,为研究新型H5亚型AIV的流行情况,在2013年10月至2016年9月期间,我们筛查了浙江地区7200份家禽粪便样本,分离到H5N6病毒37株,H5N8病毒6株,进行了病毒全基因组测序和进化分析。针对血凝素(HA)的分析表明,所有H5亚型AIV均属欧亚系,且为目前流行的2.3.4.4分支,HA裂解位点均呈高致病性特征。通过同源性分析发现,H5亚型AIV与其他AIV存在多元重组,浙江省禽类分离株的部分基因片段与人类分离株相应片段高度同源,具有一定的人类感染风险。第二部分,为评价新型H5亚型AIV对哺乳动物致病性特征,本研究选择浙江代表株6D2(H5N6)和W24(H5N8)进行小鼠感染实验。结果发现6D2和W24对小鼠具有低致死性。同时为模拟其跨种间传播中发生的致病力变化,通过小鼠肺传代实验,进行全基因组测序分析,找出适应性突变位点。在传至10代过程中出现HA(A150V)、PB2(E627K)和PA(A343T)等氨基酸变异。鼠适应株对小鼠致病力较野生株有明显升高,可导致100%小鼠死亡。此外,采用二代测序方法,还发现了 HA(R239H)和PB1(T11OM)等变异对小鼠适应过程也具有重要意义。在最初4代中,氨基酸变异最多,随后新突变出现频率渐趋平缓。这些结果对于了解AIV变异规律具有重要参考意义。第三部分,为进一步验证上述出现的突变位点对新型H5亚型AIV的毒力增强作用机制,我们通过反向操作技术,构建了重组6D2和W24病毒株。结合三维结构分析和受体亲和力分析,在细胞和动物模型中证实HA(A150V)变异能增强对人类受体的结合能力,PA(A343T)和PB2(E627K)变异增加了核蛋白复合物的聚合酶活性,从而导致病毒复制力及毒力明显提高。研究结果提示,上述变异位点在跨种间传播过程中具有重要意义,在今后临床检测过程中值得引起高度关注。综上所述,本研究得到如下结论:1.浙江省流行H5毒株以2.3.4.4分支为主,主要为欧亚系,具有高致病毒株特征,与其他亚型AIV存在多元重组现象。2.在新型H5亚型AIV中首次发现并验证了 HA(A150V)、PA(A343T)和PB2(E627K)变异在跨种间传播过程中具有重要意义。总之,在新型H5亚型AIV不断出现人类感染的背景下,本研究通过对新型H5亚型AIV的系统性调查和跨种间传播机制的研究,初步了解了其在浙江地区的流行情况,基本阐明了新型H5亚型AIV适应哺乳动物的可能变异导致高致病性的机制。本研究为我国H5亚型AIV的防控提供了重要参考,也对疫苗和药物的研发具有重要指导意义。