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胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤，其中胰腺导管腺占85-95％。该疾病恶性程度高、发病隐匿、手术切除率低，因而预后极差。胰腺癌的一年生存率约为18%，5年生存率仅为1.2-6％，总体治疗效果不佳。胰腺癌的治疗要取得突破性进展，必须加强新型肿瘤标志物的研究，以改善胰腺癌的早期诊断能力，提高手术切除率；同时应寻找更加有效的靶向治疗药物，以解决当前胰腺癌综合治疗效果不佳的难题。从这两个方面入手，一方面需找到一种敏感性和特异性均较高的肿瘤标志物以实现肿瘤的早期发现和早期诊断，另一方面需寻找到新的、有肿瘤特异性的有效治疗靶点，以实现胰腺癌的个体化治疗。骨桥蛋白参与调节细胞的增殖及存活等生物学功能，并在某些肿瘤的发生、发展、侵袭、转移以及干细胞化过程中发挥着重要作用。由于骨桥蛋白广泛存在于患者的体液及肿瘤组织中,且在多种肿瘤中出现高表达，因而有望作为一种无损伤性的肿瘤诊断及治疗标记应用于临床中；同时，骨桥蛋白也是一个重要的肿瘤转移基因,其在肿瘤的基因治疗中具有广阔的前景。 研究目的： (1)在前期研究基础之上，检测骨桥蛋白及其亚型在肿瘤组织以及不同细胞株中的表达情况，以明确骨桥蛋白在胰腺恶性肿瘤中异常表达的普遍性，讨论骨桥蛋白作为胰腺癌肿瘤标志物的潜在可能； (2)运用RNA干扰抑制骨桥蛋白mRNA，下调肿瘤细胞中骨桥蛋白的表达。通过比较骨桥蛋白被抑制前后肿瘤细胞株的生长曲线、细胞周期、粘附能力与侵袭能力等生物学特性的变化，明确骨桥蛋白在胰腺癌发生发展过程中的重要作用； (3)借助人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，在动物实验中进一步验证通过基因干扰技术抑制骨桥蛋白后，肿瘤受抑制的情况，并与细胞实验相互印证，证实骨桥蛋白在胰腺癌发生发展中的作用及机制，同时探讨以骨桥蛋白为靶点，通过抑制骨桥蛋白来实现抑制胰腺癌进展这一治疗策略的可行性及治疗效果。 研究内容和方法： (1)选取PANC-1、BXPC-3和SW1990等三种胰腺癌细胞株，分别进行培养并传代，将细胞株以及手术切除所得胰腺癌及癌旁组织标本，分别提取总RNA、反转录并行RT-PCR，计算细胞株及相关肿瘤组织中骨桥蛋白及其亚型mRNA的相对表达量；同时提取蛋白，行Western blotting检测，了解骨桥蛋白在肿瘤组织以及不同细胞株中的表达情况。选取骨桥蛋白表达丰度最高的细胞株进行下一步的干扰实验。 (2)构建pll3.7-OPN干扰载体及pcDNA3.1-OPN过表达质粒，转染至BXPC-3细胞，RT-PCR检测OPNmRNA的抑制效果，Western blotting检测骨桥蛋白抑制效果。MTT检测细胞增殖能力，Transwell检测细胞侵袭能力，流式细胞术检测细胞凋亡与周期。通过比较骨桥蛋白被抑制前后肿瘤细胞株的生长曲线、细胞周期、粘附能力与侵袭能力等生物学特性的变化，明确骨桥蛋白在胰腺癌发生发展过程中的重要作用。 (3)包装慢病毒并检测病毒滴度，构建胰腺癌裸鼠模型并按空白对照组、阴性对照组、干扰组分别饲养。观察裸鼠肿瘤生长情况，记录实验数据并绘制肿瘤成长曲线。RT-PCR检测肿瘤组织中骨桥蛋白基因表达水平，Western blotting实验检测肿瘤组织中骨桥蛋白表达水平，与细胞实验相互印证，证实骨桥蛋白在胰腺癌发生发展中的作用，了解通过干扰骨桥蛋白实现抑制肿瘤生长的效果。 研究结果： (1)在胰腺癌组织标本中骨桥蛋白及其mRNA的表达水平显著高于癌旁组织；PANC-1、BXPC-3、SW1990等3种胰腺癌细胞株亦有骨桥蛋白及其mRNA的高表达，以BXPC-3细胞株丰度最高。在胰腺癌细胞系BXPC3中以OPNb表达为主，SW1990及PANC-1以OPNc表达为主。在胰腺癌组织中OPNa，OPNb中mRNA表达水平相当，OPNc的表达差异明显。 (2)利用RNA干扰技术可成功抑制胰腺癌细胞株BXPC-3中骨桥蛋白及其mRNA的表达水平，与之对应的是BXPC-3细胞生长停滞、凋亡增加、侵袭能力下降。 (3)该体外实验可在动物实验中得到验证，即在胰腺癌裸鼠模型中，慢病毒转染的RNAi能够抑制种植肿瘤中骨桥蛋白及其 mRNA的表达并抑制肿瘤的生长，通过干扰骨桥蛋白实现抑制肿瘤生长的效果。 (3)该体外实验可在动物实验中得到验证，即在胰腺癌裸鼠模型中，慢病毒转染的RNAi能够抑制种植肿瘤中骨桥蛋白及其 mRNA的表达并抑制肿瘤的生长，通过干扰骨桥蛋白实现抑制肿瘤生长的效果。 结论： (1)骨桥蛋白在胰腺癌中的表达是普遍现象，胰腺肿瘤及各胰腺癌细胞系均见骨桥蛋白及其mRNA的异常表达，但各细胞系蛋白及其mRNA表达水平有差异，不同细胞株骨桥蛋白mRNA亚型的表达水平有差异。 (2)利用RNA干扰技术可成功抑制胰腺癌细胞株骨桥蛋白的表达，下调OPN的表达后可以抑制肿瘤的生长和迁移。 (3)骨桥蛋白在胰腺癌发病机制中发挥重要作用，既是潜在的肿瘤诊断指标，又是可能的治疗靶点，值得继续深入研究。