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氧化应激是指细胞内的自由基产生过多,超过了细胞的抗氧化能力。过量的自由基能够引起蛋白质的氧化损伤,破坏蛋白质结构,致使蛋白质丧失原有的活性,功能异常,进一步引起细胞损伤凋亡或坏死。众多慢性疾病包括阿尔茨海病(Alzheimer’s disease, AD)等神经退行性疾病的发生都与氧化损伤蛋白有关,细胞应对氧化应激必须及时清除氧化损伤的蛋白。在真核细胞中,蛋白质分子的降解主要通过泛素／蛋白酶体系统和自噬/溶酶体系统。DSS1作为真核生物中一种高度保守的蛋白,最近发现DSS1可以作为标记物,由一种尚未鉴定的ATP酶催化,特异性的加合到氧化损伤蛋白上,此反应称为DSSylation,加合物进一步被泛素化,通过蛋白酶体降解。DSS1及DSSylation在氧化损伤蛋白降解过程中发挥的作用对于机体应对氧化应激的损伤,保持正常的生理功能具有重要的作用。栀子苷作为中药栀子中最主要的有效成分,具有抗氧化应激的作用。有研究发现,栀子苷可以通过MAPK信号通路及P13K信号通路来调节Bcl-2与血红素加氧酶-1(HO-1)的表达发挥抗氧化保护作用。本课题组前期研究发现,栀子苷还可以提高细胞内的抗氧化酶,包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活力,使抗凋亡基因Bcl-2的mRNA和蛋白的表达水平升高,凋亡相关基因p53, Caspase3与Caspase9的表达下调,来挽回甲醛处理引起的SH-SY5Y氧化损伤。这些研究主要集中于对细胞凋亡通路的影响及抗氧化酶的提高来降低自由基的含量,抑制氧化损伤蛋白的生成方面来揭示栀子苷的抗氧化机理,而栀子苷对于氧化损伤蛋白的清除作用还未被研究。鉴于DSS1及DSSylation在氧化损伤蛋白降解过程中发挥的重要作用,本实验旨在探究栀子苷与DSSylation反应之间的关系,进一步揭示栀子苷抗氧化保护神经细胞的机理。具体实验分为以下两部分内容：第一部分,用甲醛诱导的N2a氧化损伤模型,通过CCK-8检测细胞活力,显微镜观察细胞状态,流式细胞仪检测细胞内ROS的水平和Western bolt测定DSS1及其加合物的表达变化来研究栀子苷对甲醛引起的N2a氧化损伤的保护作用。第二部分,为进一步在体外研究栀子苷能否直接促进DSSylation反应,参与氧化损伤蛋白降解过程。通过DSS1、HSPA8基因的克隆,提取和纯化得到纯的DSS1与HSPA8蛋白,在体外构建一个DSSylation的反应体系,初步鉴定HSPA8是否是催化DSSylation反应的ATP酶。通过慢病毒转染CMV-DSS1-Myc-DDK目的片段到N2a中,建立一个高表达DSS1的N2a细胞系,为进一步研究栀子苷与DSSylation之间的关系做准备。各部分实验结果如下：1.CCK-8细胞活力检测及细胞形态观察实验发现,高浓度的栀子苷可以明显提高甲醛引起的N2a细胞活力的下降,能够有效挽回甲醛引起的N2a细胞形态的变化,而低浓度和中浓度的栀子苷没有发现明显的效应；2.流式细胞仪测定ROS水平及Western bolt检测DSS1及其加合物表达的实验结果表明,高浓度的栀子苷能够在氧化应激条件下,降低ROS的水平,增加细胞内DSS1及其加合物的表达量,促进氧化损伤蛋白的降解,其可能是栀子苷发挥抗氧化保护作用的途径之一；3.通过pET151/D-TOPO的克隆方法,成功获得了连接DSS1、HSPA8这两种基因的重组体pET151-DSS1和pET151-HSPA8,通过Ni金属螯合亲和层析成功分离纯化出DSS1、HSPA8蛋白；4.建立DSSylation体外反应体系,通过Western blot鉴定出HSPA8并非参与DSSylation反应的ATP酶；5.通过PCR一步定向克隆技术,成功得到了L309与CMV-DSS1-Myc-DDK的重组体,通过慢病毒介导的转染方式,成功转染重组质粒到N2a中,但由于转染效率比较低,后期没能成功获得稳定转染的N2a细胞系。实验结论如下：1.高浓度的栀子苷(250μM)可以挽回甲醛引起的N2a细胞活力的下降及形态的变化；2.栀子苷可以降低氧化应激N2a细胞内的ROS水平,同时高浓度的栀子苷(250μM)可以增加细胞内DSS1及其与氧化损伤蛋白加合物的表达量,表明栀子苷可能通过促进氧化损伤蛋白降解发挥抗氧化保护作用；3.栀子苷在体外与DSSylation反应的具体作用机制尚未明确,还需要实验进一步研究。