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生物固氮是高耗能的过程,每还原1分子N2消耗16分子ATP,因此,固氮基因的表达受到胞内严谨的调控,能量合成是影响固氮基因表达的重要因素。中心碳代谢是生物体所需能量的主要来源,α-酮戊二酸是胞内碳状态的信号分子。研究表明,微生物中氮代谢调控蛋白GlnK可通过与α-酮戊二酸结合从而感知体内碳信号并调控氮代谢基因的表达,通过直接分子对话介导碳氮代谢偶联调控。此外,研究发现某些固氮菌中,固氮特异调节蛋白NifA也具有感知并结合α-酮戊二酸的能力,表明固氮基因的表达可直接响应胞内碳信号水平。施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)是一株水稻根际联合固氮菌,该菌在低氮、微好氧条件具有固氮能力,该菌的固氮基因表达调控机制研究比较深入,但氮代谢调控系统对碳信号的感应传递模式及调控机制仍不清楚。本研究分析了 A1501菌中氮代谢调控蛋白GlnK和NifA的蛋白序列特征,并通过同源建模、位点突变、蛋白表达及蛋白-小分子互作等方法,测定了 A1501菌中GlnK和NifA蛋白与α-酮戊二酸的分子互作,比较了 NifA蛋白与突变蛋白对固氮基因表达的影响,研究结果为深入解析A1501菌的碳氮代谢偶联机制提供理论支持。取得的主要结果如下:1.序列比较及系统发育树分析表明,A1501菌的GlnK和NifA蛋白均与棕色固氮菌中的同源蛋白亲缘关系最近。A1501菌的GlnK蛋白与棕色固氮菌和肺炎克雷伯菌的同源蛋白中均含有已报道的结合α-酮戊二酸的相同氨基酸位点G89(甘氨酸)。NifA蛋白具有与棕色固氮菌结合α-酮戊二酸相同的氨基酸位点F119(苯丙氨酸)。结构域同源建模表明,A1501菌的NifA蛋白第119位点位于无规则卷曲上,该位点突变为S(丝氨酸)后的蛋白无序性显著变化,暗示该位点可能对蛋白构象及对应的调控功能具有重大影响。2.分别构建了 GlnK野生型和第89位氨基酸点突变蛋白(GlnK-G89A,由甘氨酸变为丙氨酸)的表达载体,在大肠杆菌中诱导表达和纯化;采用微量热泳动实验(microscale thermophoresis,MST)测定了 GlnK和GlnK-G89A蛋白与α-酮戊二酸的体外结合。结果表明,GlnK与α-酮戊二酸可以结合,解离常数Kd值为9.75±4.72 μM,没有检测到GlnK-G89A蛋白与α-酮戊二酸的体外结合,表明GlnK第89位点的甘氨酸残基可能在GlnK与α-酮戊二酸的结合中具有重要作用。3.分别构建了 NifA野生型和第119位氨基酸点突变蛋白(NifA-F119S,由苯丙氨酸变为丝氨酸)的表达载体,在大肠杆菌中诱导表达和纯化;采用MST实验测定了 NifA和NifA-F119S蛋白与α-酮戊二酸的体外结合。结果表明,NifA与α-酮戊二酸可以结合,解离常数Kd值为3.42±3.12μM,NifA-F119S蛋白与α-酮戊二酸没有结合能力,表明119位的苯丙氨酸残基可能在GlnK与α-酮戊二酸结合中具有重要作用。4.采用野生型nifA基因及表达NifA-F119S蛋白的突变基因分别回补nifA突变株,固氮酶活性测定表明:两个基因均能回补nifA突变株的固氮活性,其中野生型nifA基因回补菌株的固氮酶活为A1501的155%,而突变nifA基因回补只有野生型的30%左右;荧光定量结果表明,两个回补株中nifA基因均高水平表达,突变nifA基因回补nifH基因表达相对于野生型nifA基因回补下调约35%;Western Blot结果表明,突变nifA基因回补株中NifH表达量相比于野生型下降明显;以上结果表明,119位的苯丙氨酸残基在NifA激活nifH基因的转录调控中发挥重要作用。综上所述,A1501的GlnK、NifA蛋白均具有与α-酮戊二酸体外结合的能力,GlnK的G89位点与NifA蛋白的F119位点可能是A1501菌感应胞内碳信号并启动下游基因表达中的重要活性位点。