由于冷冻干燥法具有其他长期保存法无法比拟的一些优点,该方法已成为细胞长期保存方法中新的研究热点。但影响冻干细胞回收率的因素非常多,包括保护剂组成(成份和浓度)、添加洗涤方式、冷冻过程、干燥过程和复水等。本论文将围绕细胞冻干中的损伤机理这一条主线展开讨论,通过大量的实验研究这些因素对人的红细胞冻干效果的影响,利用生物化学中一些测量仪器和方法,深入探讨各种冻干损伤机理,并对人红细胞的冻干方法进行优化。目前文献中采用的红细胞冻干保护剂在种类和浓度上相差非常大,回收率也相差较大,并普遍不高。本文中实验研究了不同渗透性保护剂成份、聚合物、降温速率等因素对红细胞冻干后回收率的影响,优化冻干保护剂和程序。复水损伤是造成目前冻干红细胞回收率偏低的非常重要的原因,而目前文献中对复水损伤机理的探讨非常少。本论文中实验比较了不同复水溶液、复水温度以及复水速度对冻干红细胞回收率的影响,并深入探讨了复水损伤的一些机理问题。本论文将干燥红细胞在环境扫描电镜中利用蒸汽进行缓慢复水,观测复水时细胞体积变化,首次显微观测到了干燥细胞的复水过程。该实验结合关于保护剂添加、洗涤损伤的讨论,解释了蒸汽预复水能提高冻干细胞回收率的原因,同时也反映了冻干细胞复水时因渗透响应和体积变化造成的损伤机理。目的通过实验比较不同渗透性保护剂成份、聚合物、降温速率等因素对红细胞冻干后回收率的影响,优化冻干保护剂和程序;了解蒸汽预复水对冻干红细胞的保护机制,分析由于渗透压变化造成细胞体积变化而溶血的损伤机理,优化复水程序、降低溶血率。方法从合肥红十字会中心血站获取健康人红细胞,将其重悬于生理盐水中,以690 g离心3 min,弃上清及白膜层,再重悬于生理盐水中洗涤3次制备浓集红细胞,用压积管测得其红细胞压积(Packed cell volume, PCV)为80%～83%,留取部分作为新鲜对照。用以PBS为基液配制30.27%海藻糖(W/V)负载液,与浓集红细胞以3:1体积比混匀,封口,在湿度为50%的37℃恒温培养箱中孵育3 h。以四步等体积法往新鲜洗涤的红细胞中加入不同的保护剂,最终加入的保护剂体积和红细胞体积为4:1。每步加入后混匀,每步之间间隔3 min,以使之渗透平衡。用小冻干瓶盛装细胞悬浮液,每个冻干瓶中加入250μl,放入已设定相应冻干程序的冻干机内进行冻干。冻干结束后,将样品取出置于4℃冰箱保存。4 w后,从冰箱取出的冻干红细胞,将冻干瓶和复水液预热到37℃,分四步往冻干瓶中加入1 ml复水溶液,每步加0.25 ml,加入后轻轻晃动冻干瓶,使之混匀,每步间隔3 min。分四步加入290μl、540μl、1310μl、7860μl的PBS液,混匀,使之恢复到正常渗透压。低渗稀释后样品用氰化血红蛋白试剂盒测定其总血红蛋白浓度,再将样品以110 g离心10 min,测定上清的血红蛋白浓度。血红蛋白回收率=[(样品总血红蛋白浓度-上清血红蛋白浓度)/样品总血红蛋白浓度]×100%。比较不同渗透性保护剂成份、降温速率以及不同复水溶液、复水温度以及复水速度对冻干红细胞回收率的影响。各项数据均以x±s表示,数据分析采用Student’s t-Test检验。结果1.以1/4 PBS(即将等渗的PBS用二蒸蒸馏水稀释四倍)为基液配制如下五组保护剂:甘油组(15%PVP+4%trehalose+0.8M glycerol+1.25%BSA+0.05%HSI);二甲亚砜组(15%PVP+4%trehalose+0.8M DMSO+1.25%BSA+0.05%HSI);葡萄糖组(15%PVP+4%trehalose+0.8M Glucose+1.25%BSA+0.05%HSI);乙二醇组(15%PVP+4%trehalose+0.8M EG+1.25%BSA+0.05%HSI);1,2-丙二醇组(15%PVP+4%trehalose+0.8M 1,2-PG+1.25%BSA+0.05%HSI)。回收率分别为43.1±3.3;35.3±2.1;45.2±2.5;43.9±2.8;42.7±3.6。1,2-PG组与其余四组结果差异有显著性(P <0.01)。EG组,DMSO组,Glycerol组和Glucose组之间结果差异无显著性(P>0.1)。2.冻干保护剂的DSC扫描测试结果得到,PVP+海藻糖+甘油+BSA保护剂的结晶温度为-13.2℃,玻璃化转变温度为-38.9℃。因此应保证样品在干燥前的温度应低于-40℃左右。考虑到隔板与样品之间的传热温差(在低温下一般在15℃左右),将搁板的最低温度设定为-70℃,并且一般使样品在此温度下停留一段时间。干燥时第一步的搁板温度设定为-60℃。3.采用如下三种方式降温:在室温下将冻干瓶放置于搁板上,将冻干机搁板温度设置为快速降温,样品通过与搁板和腔体内换热,随搁板一起降温,搁板最终温度为-70℃;当搁板预冷至-70℃时,迅速将冻干瓶置于搁板上;将冻干瓶浸入液氮中30s,然后迅速取出放置于已预冷至-70℃的搁板上。红细胞回收率分别为40.8%±2.3%; 49.5%±1.9%;56.3%±1.7%(与前两组比较差异有显著性,P <0.01)。4.分别以如下五种复水液来复水:PBS;PBS与10%海藻糖溶液(以蒸馏水为基液配制)等体积混合;10%海藻糖溶液;15%海藻糖溶液;以PBS为基液配置15%PVP。红细胞回收率分别为38.2%±3.3%;40.4%±5.1%;44.0%±4.2%;42.1%±4.5%;58.5%±4.6%(与前3组有差异显著性P <0.01)。5.在0℃、10℃、25℃、37℃、42℃这5种温度下的复水的回收率显示,复水温度在0℃到37℃之间时回收率随着温度的升高而增大, 37℃下复水效果最好(53.5%±3.0%,与其他温度下相比差异有显著性,P﹤0.01),42℃下复水效果略有下降(49.3%±1.4%,与37℃相比具有差异显著性,P﹤0.01),但仍比其他低温下的复水效果好(具有差异显著性,P﹤0.01)6.对于蒸汽预复水组,将样品打开密封包装,放到细胞培养箱中放置3 h。用血细胞分析仪测定两组洗涤后红细胞的数目﹑压积﹑平均体积和分布宽度。实验组红细胞溶血率为22.2%±2.1%,对照组红细胞溶血率为35.4%±2.4%(P<0.05),差异有显著性;实验组红细胞2,3-DPG含量为(7.01±1.17)μmol/gHb ,对照组红细胞2,3-DPG含量为(6.82±2.10)μmol/gHb(P>0.05);实验组红细胞ATP含量为(5.13±0.52)μmol/gHb ,对照组红细胞ATP含量为(5.22±0.10)μmol/gHb(P>0.05);与对照组比较,实验组的压积回收率和细胞平均体积(Mean corpuscular volume, MCV)明显增高(P<0.05),体积分布宽度(Red cell volume distribution width, RDW)明显下降(P<0.05)。结论1.冻干保护剂的选择:15%PVP+4%trehalose+3%glycerol+5%BSA+0.05%HSI能够较好的保护红细胞。2.最佳冻干程序:冻干瓶浸入液氮中30 s,然后迅速取出放置于已预冷至-70℃的搁板上停留10 min后开始冻干。初级干燥中,设定搁板温度在-60℃、-50℃、-40℃、-30℃下使样品各干燥3小时,在-20℃、-10℃、0℃下各干燥2 h;次级干燥为在10℃下2 h,干燥腔体内压力设定为100 mTorr(13.3 Pa)。冷凝器温度为-85℃。整个干燥过程持续时间大约20 h。最终残余含水量一般为3%～4%。3.复水条件的选择:采用以PBS为基液配制的15%PVP溶液复水能提高复水后红细胞的回收率;37℃复水效果最好,红细胞回收率与其他温度下相比具有差异显著性(53.5%±3.0%,P﹤0.01);经过37℃蒸汽预复水能显著提高复水后洗涤前和洗涤后的细胞回收率。