小分子化合物可以通过对细胞内大分子的作用来调节其功能,从而影响细胞的进程。小分子化合物的这种作用,使其在药物开发和生命科学研究上的应用非常广泛。由于许多药物都是基于细胞表型的筛选而发现的,这类药物的作用靶点和作用机理往往是未知的。对于药物作用靶点及其作用机制的研究可以更好地了解药物的治疗效果及其副作用,也为第二代药物的研发提供了很好的导向。然而,尽管技术在不断发展,但是生物活性的小分子化合物的靶点鉴定仍然是药物化学和化学生物学领域的一个关键问题。常用的靶点鉴定方法大致可以分为两种类型：一种是直接分离鉴定可以与小分子化合物结合的蛋白；另一类方法是通过组学的方式,比如基因组学和蛋白质组学,来寻找化合物作用后的基因和蛋白水平的变化,从而间接的推倒出化合物的作用靶点。与后者相比,直接分离鉴定靶点的方法的好处是可以得到直接的靶点蛋白信息,容易找到化合物最上游的作用靶点。这类方法主要是以亲和纯化为基本思路,需要将化合物连接上可分离的固相载体或者可直接观测的荧光分子等,主要包括亲和层析法、生物素化法、同位素或荧光标记法、光亲和法等。其中,最简单最经典的亲和层析法需要把所研究的化合物修饰后连接到固相载体上,然后与所需的细胞、器官或有机体的裂解物孵育,通过简单的过滤、洗涤、和洗脱将亲和结合而来的蛋白从细胞的全蛋白中分离出来。这种方法的好处在于操作简便,体系复杂程度低,以及适用范围广。然而,由于化合物连接在固相载体上可能使其失去原有的生物活性,从而无法与靶点蛋白结合,所以该方法最大的缺陷在于无法检测连接在固相载体上的化合物是否仍然保持其原来的生物活性。针对这一点,我们建立了一种利用纳米探针来鉴定化合物靶点蛋白的方法。将待鉴定的小分子化合物修饰连接上含有硫辛酸的结构,使其可以通过金硫键连接在金纳米颗粒表面。这种表面连接有小分子的金纳米探针可以从细胞的全蛋白中“钓”出与小分子特异性结合的靶点蛋白。这种方法是基于亲和层析法建立的,却弥补了亲和层析法的不足。由于金纳米材料具有易于合成,易于表面修饰,易于被细胞摄取,金纳米本身的细胞毒性较小等特点,该方法的优势在于可以进入活细胞,在鉴定靶点蛋白之前判断连接在纳米颗粒上的小分子是否仍保持其生物活性,从而提高靶点鉴定的准确率。运用这个方法,我们成功地鉴定了能选择性杀死非小细胞肺癌H460细胞的噻唑烷酮类化合物1的作用靶点。在鉴定靶点之前,我们先检测了连接有化合物1的金纳米探针对H460细胞的杀伤作用。在确定了金纳米探针基本保持了化合物1原有的生物活性之后,才开始利用该金纳米探针进行靶点的分离与鉴定。在鉴定的过程中,我们利用了一个与化合物1结构相似的对H460细胞抑制作用很弱的化合物3作为阴性对照,经SDS-PAGE分离后,成功地观察到两条与化合物1特异性结合的蛋白的条带。之后,通过对这两条带中的蛋白进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF/TOF MS)分析和Mascot数据库检索,确定了化合物1的靶点蛋白为微管蛋白(a-tubulin)和热激蛋白90(HSP90)。我们利用细胞外微管聚合实验,H460细胞的微管免疫荧光检测和微管损伤下游蛋白JNK磷酸化的检测,验证了化合物1对微管蛋白的靶向作用；同时,通过检测HSP90底物蛋白CRAF-1, ERBB2和磷酸化的AKT在细胞内的水平,也验证了化合物1对HSP90的作用。我们的工作证明了纳米技术在药物发现和化学生物学研究领域中的重要价值。以往的靶点鉴定方法都必须在知道靶点之后再进行靶点真实性的判断,这将是一个冗长又昂贵的过程,使得作用机制的分析成为药物发现的一个限速步骤。而纳米探针的应用,可以在靶点鉴定之前对探针的生物活性保持与否做出预先的判断,从而提高研究效率,所以纳米探针在这个领域将扮演一个至关重要的角色。除此之外,我们还揭示了新型噻唑烷酮类化合物的微管干扰作用及其双靶向的特性。微管蛋白作为常用抗癌药物的主要作用靶点之一,一直以来都受到广泛的关注。从微管蛋白正常的聚合/聚被破坏到最终导致细胞死亡的整个过程,受到细胞内多种信号分子的调节。其中,细胞激酶就是一类起关键作用的信号分子。在微管损伤之后,一些激酶可以介导细胞存活,抑制凋亡的发生,而另一些激酶的激活却可以促进细胞凋亡。目前,仍然有很多与微管损伤相关的激酶需要进一步的探究,更好地理解微管损伤与激酶的关系将会大大增强癌症治疗的效果。鉴于本实验室合成的新型噻唑烷酮类化合物可能作用于微管蛋白及其双靶向的潜质,我们从一系列噻唑烷酮类化合物中筛选出两个在细胞外具有相似抑制微管聚合能力的化合物(探针A和探针B)。通过研究这两个化合物在细胞中的不同效应及对激酶不同的作用能力,来深入探讨激酶在微管损伤后的影响。我们发现,虽然探针A和B在细胞外抑制微管蛋白聚合的能力相当,但是二者在细胞水平上对微管的影响,细胞周期阻滞的恢复及细胞凋亡的程度都有明显的差别。通过体外激酶实验发现,探针A可以显著抑制Dyrk1B激酶的活性,而B化合物对所检测的激酶都没有明显地作用。我们进一步检测了探针A和B在细胞内对Dyrk1B激酶的影响,发现探针A和B引起微管损伤后都可以激活Dyrk1B激酶,但是探针A作用的细胞中Dyrk1B激酶的活性远低于探针B作用后的活性,这不仅更加充分地证明了探针A对Dyrk1B激酶的抑制,而且表明了Dyrk1B激酶在微管损伤后活性会显著的提高。根据已有的关于Dyrk1B激酶介导细胞存活功能的报道,以及我们以上的研究结果,可以认为Dyrk1B激酶在微管损伤后被激活,从而起到保护细胞,维持细胞生存的作用。通过进一步的研究发现,在微管损伤后Dyrk1B激酶介导细胞存活主要通过以下两个途径：一方面,通过促进微管相关蛋白4(MAP4)的表达量升高,从而增强微管的稳定性并使细胞周期从G2/M期阻滞中恢复；另一方面,通过磷酸化p21蛋白促进其向线粒体的转移,从而通过抑制caspase-3的活性来抑制凋亡的发生。除了探究Dyrk1B激酶与微管损伤的关系,本研究还首次报道了一个可以同时抑制抗癌靶点及该靶点抑制引起的修复途径的双靶向化合物探针A。与单靶向微管的探针B相比,双靶向作用带来了高出10倍的癌细胞抑制能力,这为新的抗癌策略的设计提供了新的思路。