论文部分内容阅读
全世界每年有1100万人受到不同程度的烧伤,需要针对烧伤引起的疼痛实施有效的治疗方法。目前缓解烧伤疼痛的方法主要是传统的治疗方法。大多数不能有效的改善烧伤痛。烧伤疼痛的早期是炎性痛,后期为神经病理性疼痛。本实验为了研究如何对烧伤进行镇痛,选择SD大鼠后足热损伤模型为试验对象进行研究。研究的目标锁定为,SCN9A,慢病毒介导的shRNA。 SCN9A位于2号染色体,全长约6000bp,有26个外显子,是编码河豚毒素(TTX)敏感的电压门控钠离子通道Nav1.7的α亚基,其主要表达在外周背根神经节和交感神经节神经元中。Nav1.7通道可以产生大量斜坡电流使去极化缓慢,因此,可以使小的阈下刺激放大,因此作为一个重要的决定因素阈值的伤害感受器终端。 为了使对Nav1.7的抑制更为有效,我们选择应用RNA干扰技术抑制Nav1.7。 RNA干扰技术可以特异性的抑制靶基因的表达。近年来此项技术已经作为基因治疗中的有效手段在研究中广泛的应用。现在已经有一些药物应用到了临床。但是,生物的或者化学合成的siRNA很容易就会被RNA酶分解掉。所以具有,转录效率低,干扰效果不持久,生物利用度不高的缺点。这样的病毒载体介导shRNA,病毒载体介导的转染效率得到有效改善,能有效抑制靶基因的长期表达。慢病毒作用时间持久,不会诱发免疫反应,现如今经成为热门课题。 因此,本实验建立热损伤大鼠模型,通过应用慢病毒介导 shRNA对 DRG中的 Nav1.7进行抑制,来检测抑制 Nav1.7前后,模型大鼠的痛阈变化,以及在分子水平和蛋白水平上Nav1.7的变化,为应用慢病毒介导shRNA来抑制特定基因表达提供理论依据,为使用其治疗疼痛提供新靶点。 目的: 通过研究热损伤模型Nav1.7的变化,并且通过尝试应用慢病毒介导shRNA来抑制Nav1.7,来证明慢病毒介导shRNA来抑制Nav1.7能够缓解烧伤引起的疼痛。 方法: 1建立2级烧伤模型:在65度的水浴槽上放置铁板,把大鼠的左侧后足置于铁板上15S。 2机械痛域的测定:大鼠后足50%缩足阈值测定(von Frey test)即大鼠在刺激时间内会出现快速的缩足动作。应用 Dixon的方法推算出相应的大鼠后足50%缩足阈值。在阈值小于4g便可以认为发生痛敏现象。 3热痛域的测定:用泰盟PL-200热刺痛仪测定大鼠双侧后足的热刺激缩足阈值(heat hypersensitivity,ipsilateral)。 4统计学软件分析各个模型组的痛域变化曲线,得出相应的结果。 5免疫荧光双标目的蛋白:我们用于对Nav1.7进行准确定位和半定量检测,可以很直观的展示实验的结果。 6用Western blot(蛋白印迹法)测定各模型组Nav1.7在蛋白水平的相关表达情况。 7热痛模型大鼠左侧L5 DRG注射慢病毒或空病毒,建立病毒模型和空病毒模型,目的是有效的抑制Nav1.7的表达。 结果: 1成功建立 SD大鼠热痛模型,发现机械痛域和热痛域与 Nav1.7的表达量相关。免疫组织化学和Western blot检测出烧伤后Nav1.7上调。 2在SD大鼠热痛模型的基础上,用过DRG注射应用慢病毒介导shRNA能够有效抑制钠离子通道Nav1.7的上调,并且能减轻疼痛。 结论: 1通过建立大鼠热损伤模型检测出Nav1.7和疼痛密切相关。 2应用慢病毒介导的shRNA能够有效抑制钠离子通道Nav1.7的上调,从而减轻疼痛。