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线粒体反向调控途径(Mitochondrial Retrograde Regulation,MRR)是植物线粒体与细胞核之间发生信息交流的重要途径。当线粒体功能受到线粒体基因突变或逆境胁迫影响时,线粒体会将这些逆境信号通过一些信号分子或信号转导蛋白传递到细胞核,从而引起细胞核内基因的表达变化,进而影响细胞内的代谢活动。已知抗霉素A(AntimycinA,AA)可以抑制线粒体电子呼吸传递链,诱导编码交替呼吸途径交替氧化酶(Alternative oxidasela,AOXIa)的表达,因而常被作为线粒体反向调控研究的报告基因。AOXla可以响应多种逆境信号并被诱导表达。
本研究以酵母线粒体反向调控机制和植物交替呼吸途径的产生机理为理论依据,以模式植物拟南芥为实验材料,一方面通过同源性筛选比对,获得了五个与酵母RTG(Retrograde)途径中的调控因子具有较高同源性的候选基因,并筛选获得了相应的T-DNA插入突变体,另一方面通过EMS诱变拟南芥Col(:) LUC材料得到ems2突变体。继而从这几个候选基因中筛选鉴定出参与线粒体反向调控的基因。同时,本研究以细胞质雄性不育系CMS和其保持系MF为实验材料,初步研究了茎用芥菜中交替氧化酶基因BjAOXla的调控机理。得出的主要结论如下:
1 GRF3是植物线粒体反向调控途径中的负调控因子
GRF3(General Regulatory Factor3)是拟南芥中与酵母反向调控途径负向调控因子Bmh1/2p具有较高同源性的基因。GRF3突变体(grf3)在受到50μMAA处理后,其过氧化氢(H2O2)的含量增多,AOXla的转录水平显著上调。当用20mMH2O2处理1小时后,grf3中AOXla迅速上调表达,上调幅度比AA处理小。NDB2(NAD(P)H dehydrogenase B2)是与AOXla协同表达的胁迫响应基因,研究发现AA处理后,它被诱导表达的趋势与AOXla一致。该结果从基因转录水平证明了GRF3是植物线粒体反向调控途径中的负调控因子。
2 EMS2是植物线粒体反向调控途径中的正调控因子
EMS2突变体(ems2)是拟南芥转基因植株Col(:) LUC经EMS诱变获得的,该突变体含有荧光素酶(LUCIFERASE,,LUC)的报告基因。AA或H2O2处理后,ems2中AOXla和NDB2被诱导表达水平均显著低于转基因植株Col(:) LUC,即从转录水平上证明了EMS2是植物线粒体反向调控途径中的正调控因子。
3 CMS系中AA处理不能诱导BjAOXla的表达,其正调控基因BjCDKE1表达水平较低
AA处理后,MF植株的BjAOXla基因被诱导表达,而CMS系中BjAOXla基因没有明显被诱导。未处理时,BjCDKE1基因在CMS中的表达水平明显低于MF,而被AA处理后,其表达在CMS中几乎没有变化,而在MF中显著下调表达。BjAOXla基因的具体调控机理仍待进一步研究。