蓝藻分子生物学的飞速发展已使其成为生物学的前沿。近几年来，以蓝藻为宿主的基因工程发展迅速，使转基因蓝藻已有希望制备药物或处理环境问题。但迄今为止，国内外用蓝藻表达外源基因的表达效率都不高。为了使转基因蓝藻在应用上产生较好的社会效益和经济效益，必须进一步提高外源基因在蓝藻中的表达效率，以及提高光合效率、加速生长。 本研究用人肿瘤坏死因子α（Human Tumor Necrosis Factor α，简称hTNFα）作为外源目的基因。它是由巨噬细胞和单核细胞受到刺激后产生的一种多功能蛋白质细胞因子。hTNFα有多种生物学效应并作为信号传导体，其中最引人注目的是它对肿瘤组织和肿瘤细胞直接地、特异性和广谱性地杀伤作用，极有希望制成抗癌剂的天然因子之一。但是用大肠杆菌得到的重组产物需要严格纯化，通常用于静脉注射。但由于毒副作用大，十几年来国内外一直停留在临床实验阶段。我们研究组建议用蓝藻为宿主表达hTNFα制备口服剂，来减缓毒副作用，已经得到了转基因鱼腥藻，并测得产物具有抑瘤的生物学活性。但是表达效率一直不高，并且它的表达对蓝藻生长有些抑制。 由于蓝藻是原核生物，基因的表达调控主要是在转录水平和翻译水平。因此，寻找在蓝藻中高效的启动子，改变SD序列的结构是提高外源基因在蓝藻中表达效率的有效手段。本研究将连有不同SD序列的TNFαcDNA克隆到穿梭表达载体pRL-489的启动子（PpsbA）下游，构建2个鱼腥藻7120的穿梭表达载体（pMD-489-TNF1，2），通过三亲接合转移法分别导入鱼腥藻7120细胞。用放射免疫法定量分析TNFα在转基因蓝藻中的表达效率。结果表明，有效地提高了TNFα在鱼腥藻7120中的表达。TNFα的表达量占总可溶性蛋白的2.1-2.9％和0.15％，表达效率分别提高到原来的21-29倍和1.5倍。 在培养转基因鱼腥藻中，观测到它们在形态和生理上都发生了变化，这反应了TNFα基因的转入和表达对宿主光合作用的影响。 光学显微镜和扫描电子显微镜的观察发现：转基因鱼腥藻比野生型异形胞数目减少约30％。转入空质粒的营养细胞比野生型略大，转TNFα基因的鱼腥藻异形胞体积明显增加，而营养细胞比正对照和野生型小。到了生长后期，转TNFα基因的鱼腥藻营养细胞体积明显增大，多与异形胞相当，有的甚至比异形胞大。转pMD-489-TNF1的鱼腥藻细胞内出现明显的空腔。通过透射电子显微镜的观察发现：转基因藻中的类囊体膜片层结构更加明显。中国科学院植物研究所硕士论文 前言 转基因藻和野生藻的生长曲线的比较表明，转入空质粒仰－489对宿主的生长几乎没有影响，甚至还略快于野生型；rfNFa的表达对细胞的生长有一定副作用，胞内TNFa的含量高时，细胞数增长缓慢，并且平台期时细胞数有一定下降。 从光合作用光强曲线的分析可见，转TN’Fat困的鱼腥藻有较低的光饱和点，暗示了 IN’－－a的表达可以增强宿主对光的敏感性；同时，TNFa的转入使宿主的呼吸作用加强，几乎比野生型和转空质粒的正对照高一倍，显示了T’NFa基因的转入和表达可能给宿主带来更大的代谢负荷；在光饱和点以上，几种藻的真实光合放氧能力大致相同，表明TN’Fa的表达没有破坏宿主的光合反应中。c。 从室温吸收光谱分析可见，转基因蓝藻有相对较高的类胡萝卜素和叶绿素a蓝峰，转TN－Fa基固的鱼腥藻显示了藻蓝蛋白含量有所降低。因为蓝藻的主要天线色素为藻胆蛋白，藻蓝蛋白相对含量的下降可能与宿主对光更敏感有关。 从低温荧光发射光谱分析可见，转 ’I’N’Fa基因的鱼腥藻7120光系统＊能量分配较高。可能是T’iW a基困的转入提高了藻胆蛋白的吸收和传递光能的效率。 从叶绿素荧光动力学分析可见，鱼腥藻7120在生长的过程中PSll的活性存在一个变化的过程。TNFa的转入和表达在对数后期提高了宿主的光系统＊原初光能转化效率。 从转基因藻光系统 1和光系统＊光合放氧活性分析与 TN’Fa表达随培养时间变化曲线表明，转TN’FO基因鱼腥藻的光合放氧活性比野生型和正对照高，尤其是显著地提高了宿主的PSll活性。 用自然界中原来不存在的转基因鱼腥藻作上述研究表明：原来只存在于高等、异养的人类和哺乳动物中的T’i－’ a基困，一旦转入最古老的放氧光合生物后，其表达可被调控；同时TN’Fa的表达又能影响宿主的光合作用。它提高了宿主对光的敏感性、光系统＊的活性和对光能的利用率。这似乎都表明TNFa在蓝藻细胞中起信号传导体的作用。而且，这些数据的积累，还有助于我们优化培养条件，提高TN’Fa的表达效率，为产业化做好准备。