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背景／目的 端粒酶活性在恶性肿瘤中的高表达，使之成为目前肿瘤治疗的重要靶点。选择性抑制端粒酶特别是TERT的表达可有效地抑制肿瘤细胞的生长。针对端粒酶的反义核苷酸技术是基因治疗药物设计的研究热点。然而，目前反义药物的设计仍停留在低效和随机的水平，影响了其治疗的应用效果，反义药物的优化设计已成为研究者们致力于解决的难题。本课题拟利用现有远程WEB网生物网络资源，以TERT mRNA为靶点，从靶mRNA的一／二级结构、反义药物与靶序列之间反应自由能变化（ΔG°）以及mRNA系统发育保守性几个方面综合考虑进行反义药物优化设计，以期提高设计的成功率，并发掘反义药物设计的一般规律。 方法 选取人端粒酶催化亚基（hTERT）mRNA作为靶标进行抗肿瘤反义寡核苷酸（antisense oligodeoxyonucleotide,ASODN）的靶向设计和药理学评价，利用自行设计的程序构建了基于远程WEB的生物信息分析平台，针对人mRNA的一级结构的mRNA 5’端，启动密码AUG周围和核糖体的装配部位、编码区和非编码区、进化保守区，以及二级结构单元中结构不稳定的区域重叠部分作为反义药物设计的靶位，筛选出若干个作用效果明显的ASODN。对疗效突出的寡核苷酸候选序列进行体内体外抗肿瘤活性评价，进一步分析其导致人肠癌Lovo细胞凋亡前后的基因表达谱的差异，探讨ASODN抑制人端粒酶催化亚基转录后至翻译前时期细胞调控网络的变化。 结果 1．构建了基于远程WEB的生物信息分析平台。使用基因功能区定位软件分析mRNA一级结构的编码区和非编码区、同时利用同源性比较软件进行物种序列分析以确定进化保守区。再进一步使用mRNA二级结构模拟程序预测人TERT mRNA的二级结构，针对二级结构中膨胀环、内环、发夹、多分支连接部等结构不稳定区域，设计合成靶向TERT mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASODN）。以目前国际上已进入临床试验的靶向人类端粒酶RNA模板反义寡核苷酸TTAGGG为阳性对照，结果表明在所设计的29个反义药物中，3个ASODN IC50值(分别为48±7，50±4，64±2．7 nmol1.L-1)显著低于对照的TTAGGG(81±25nmol.L-1)。根据体外药效评价结果，使用统 — — — —计软件SPSS进行构效关系（QSAR）分析显示，构成靶H级结构单元膨胀环、内环、结点碱基数、药物结构自由能和反应自由能在QSAR方程中有统计意义。提示以模拟二级结构为基础的计算机辅助药物设计有助于提高反义药物设计的效率并获得体外药效优于TTAGGG的反义药物。 2．验证了QSAR方程对所设计反义药物药效预测的可靠性。本课题结合靶 mRNA系统发育比较分析和二级结构预测，针对系统发育保守性不同的区域再次设计了 10个 ASODN。结果表明，其中 8个 ASODN与 TTAGGG的实测 IC。。与上述 QSAR方程预测的 IC。值相符，线性回归分析显示 ASODN的实测与预测IQ。之间有较好的相关性，相关系数为0．76(P＜O．0引。提示上述QSAR方程一定程度上反映了ASODN活性与靶结构的关系，对预测反义药物的生物活性有所帮助。 3．体外和体内药效评价显示反义药物对肿瘤细胞有明显的抑制作用。体外试验中，观察了ASODN对人大肠癌LOVO细胞系和鼠源性黑色素瘤B16－BL6细胞系的增殖抑韦作用卜’。结果显示，其中有 3个ASODN：AT0155 （20），AT01S6（20）与AT1261（20）对LOVO细胞增殖抑策的IC朋值显著低于 TTAGGG（P＜0．05）。对于 B16－BL6细胞，其中 5个 ASODN：AT0155（20），AT0186（20），AT0478（20），AT1261（20）及 AT1999（20）的 IC；。值低于100nM，而 TTAGGG对该细胞株的增殖无抑制效应。在体内药效评价实验中，使用BALB八裸鼠荷人源性LOVO肠癌肿瘤模型进行评价。结果显示，对于LOVo肿瘤，AT1261（20）在 0．5，0．25，0．05，0．005mg／kg／day的剂量下对肿瘤生长的抑制率分别为 89．2％，79．3％，64．l％及 ZS．8％，而 TTAGGG在 0．5。g／kg／day的剂量下对 Lovo肿瘤生长的抑制率为 69．2％，显著低于同等剂量的 AT1261（20）(P（．05）。而 TTAGGG对鼠源性肿瘤的生长无抑制活性：｝个错序与随机对照吁mN无体内抑瘤活性。 4．揭示了“靶域”的特征。通过对上述ASODN，如AT1624（20），AT0022 （20），AT1261（20）和 AT0186（20）等进一步分析，发现有效的反义药物相对集中地分布于由若干二级结构单元组成的局部二级结构区域，且集中于同一局部二级结构区域的反义药物活性相似”’「”。我们将这种局部二级结构区域称为“二级结构靶域”（“靶域”）。“靶域”具有如下特点：①局部结构相对稳定（在计算机模拟的最优及次优结构中该结构维持不变）；②区域内包含不少于一个的不稳定二级结构单元（结构自由能＞o）；③具有高度的系统发育保守性。体外细胞MTT法与原位杂交方法证实针对不同