第一部分Notch信号系统对骨骺干细胞生长的调控作用实验1骨骺干细胞的体外培养及生长特性观察目的:探讨体外培养鼠骨骺干细胞及其生长特性观察,为其应用奠定基础。方法:采用显微取材后酶消化获取骨骺干细胞,用Percoll密度梯度离心法纯化,并测定其细胞生长曲线、细胞分裂指数、碱性磷酸酶活性,用免疫组化及免疫荧光染色的方法检测Ⅱ、Ⅹ型胶原的合成情况和透射电镜观察粗面内质网的丰富程度。结果:鼠骨骺干细胞形状类似成纤维细胞,呈梭型,碱性磷酸酶活性低,粗面内质网少,Ⅱ型胶原合成量较多。结论:体外培养的骨骺干细胞能向成熟阶段分化,可为软骨或骨组织工程提供理想的种子细胞。实验2 Notch1信号系统对骨骺干细胞增殖与分化调控作用的初步观察目的:研究激活的Notch1信号系统对体外培养的骨骺干细胞增殖与分化的调控作用。方法:向体外培养的骨骺干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂γ-secretase inhibitorⅡ(MW167),空白对照加PBS缓冲液。用RT-PCR、免疫组化、MTT、流式细胞仪、碱性磷酸酶染色和Western Blot方法检测。结果:骨骺干细胞中有Notch1和Jagged1表达;与对照组相比,rhNF-κB诱导组表达PCNA、CollagenⅡ蛋白明显增多,促细胞增殖作用明显(p=0.027),并且进入分裂期(S期)细胞增多(26.54%),而MW167诱导组碱性磷酸酶、CollagenⅩ蛋白表达明显增多,CollagenⅡ蛋白及分化标志蛋白stathmin表达明显减少。结论:当Notch信号系统被激活时,骨骺干细胞进行增殖;当Notch信号系统被抑制时,骨骺干细胞进行分化。实验3激活的Notch1信号系统抑制骨骺干细胞凋亡及其机制研究目的:研究激活的Notch1信号系统抑制体外培养的骨骺干细胞凋亡及其机制。方法:用RT-PCR检测骨骺干细胞中Notch信号系统的表达,并分别向培养细胞中加入Notch1激活剂rhNF-κB、抑制剂γ-secretase inhibitorII(MW167)和Bcl-2抑制剂HA 14-1,空白对照加PBS缓冲液,在凋亡诱导剂Celecoxib诱导后,用MTT检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡和Western Blot检测Hes-1及Bcl-2蛋白的表达。结果:骨骺干细胞中存在Notch1/Jagged1信号通路,rhNF-κB组细胞活力增加,凋亡较少,Hes-1蛋白和Bcl-2蛋白表达明显增加,而MW167组、HA 14-1组和对照组细胞凋亡明显,差异有显著意义(p<0.05),且HA 14-1组和HA 14-1协同rhNF-κB组无Bcl-2表达。结论:激活的Notch1信号系统通过促进靶基因Hes-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制骨骺干细胞凋亡。实验4 Notch信号系统对体外培养的鼠肢芽生长的调节作用目的:研究Notch信号系统对体外培养器官生长的调节作用。方法:体外培养孕16天鼠肢芽,通过测量其纵向生长长度、HE染色和甲苯胺蓝染色观察骨骺干细胞增殖与分化。结果:与对照组相比,rhNF-κB实验组鼠肢芽纵向生长迟缓,MW167实验组纵向生长速度较快,差异有显著意义(p<0.05)。rhNF-κB实验组表现出静止区骨骺干细胞明显增多,增殖区和肥大区成熟细胞所占比例较少;MW167实验组表现出骨骺干细胞明显处于分化状态,静止区骨骺干细胞非常少,增殖区和肥大区成熟软骨细胞所占比例明显增多。结论:激活的Notch信号系统不仅对体外培养的骨骺干细胞增殖、分化有调节作用,而且对肢体内骨骺干细胞的增殖与分化也有调节作用。第二部分Notch和PTHrP双信号系统的调控作用实验5 Notch和PTHrP双信号系统调节鼠骨骺干细胞增殖与分化及其机制研究目的:研究Notch和PTHrP双信号系统对骨骺干细胞生长的立体调节及其机制。方法:通过免疫组化的方法检测Notch、PTHrP和AP-1共表达;转染PTHrP后MTT检测PTHrP协同Notch促进骨骺干细胞增殖,Western blot方法检测PTHrP协同Notch抑制其分化及PTHrP和AP-1的表达。结果:当Notch信号系统被激活时,明显促进PTHrP和AP-1蛋白的表达;转染PTHrP基因后,促进骨骺干细胞增殖作用明显加强(p<0.05),collagenX表达也明显减少,明显抑制骨骺干细胞分化;Notch被激活时,明显促进AP-1和PTHrP表达,Notch被抑制时,无AP-1和PTHrP表达。结论:Notch通过介导AP-1来促进PTHrP的表达,Notch起横向调节作用,PTHrP起纵向调节作用,在骨骺干细胞生长分化过程中成立体调节。