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骨骼是人体重要的组织器官，是机体机械运动的基础。近年的研究发现，骨骼系统参与了生理及病理条件下机体代谢、内分泌和造血功能的调控。良好的骨骼发育是机体健康的基础，骨骼发育具体机制的深入探索对寻找骨骼疾病新的治疗措施与方案具有重要意义。骨骼发育包括软骨内成骨和膜内成骨两种途径，是一个高度有序、受到多种因素共同调控的过程。软骨内成骨是哺乳动物骨骼形成的主要途径。成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factors，FGFs）及其受体成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growthfactor receptors，FGFRｓ)在调节软骨内成骨中发挥重要的作用。FGFR3属于酪氨酸激酶受体家族，其基因突变与多种骨骼发育性疾病密切相关。通过对FGFR3基因工程小鼠的深入研究表明，FGFR3在骨骼发育调控中发挥重要作用。模拟人软骨发育不全的FGFR3功能增强型（gain-of function）点突变小鼠模型(FGFR3G369C/+小鼠，即ACH小鼠)表现为身材短小，长骨生长板结构紊乱，软骨细胞增殖速度减慢。ACH小鼠软骨细胞的分化受到抑制，表现为肥大软骨细胞数量减少，肥大带变窄，伴X型胶原表达明显降低。FGFR3全身敲除小鼠则出现与之相反的表型，其长骨过度生长，出现脊柱侧弯，长骨生长板变宽，肥大软骨细胞数量显著增加，伴随X型胶原表达增高。目前观点认为FGFs与受体FGFR3结合后能够激活下游STAT1/p21、MAPK、PLC-γ和PI3K等信号通路，此外，还能够与IHH/PTHrP环路等其他重要信号通路相互协调，对软骨内成骨过程起负性调节作用。然而目前对于由FGFR3突变所致的骨骼发育性疾病尚无有效的治疗措施，科学家们针对FGFR3及相关的信号通路所采取的干预措施并不能完全缓解由FGFR3异常激活所致的骨骼发育异常。这提示FGFR3激活后可能通过其他的机制参与了对骨骼发育过程的调控。除了FGFs/FGFR3外，许多重要的信号通路也参与了骨骼发育的调控，如Wnt/βcatenin、IHH/PTHrP、1,25(OH)2D3/VDR等。1,25(OH)2D3/VDR信号通路在哺乳动物钙、磷代谢及骨稳态的维持中发挥重要作用。1,25(OH)2D3与FGF23和PTH一起构成调节环路，参与对钙磷代谢的精确调控。近年来研究发现，1,25(OH)2D3/VDR信号通路同样参与了软骨发育过程的调控。在体外试验中，我们以及其他课题组的结果均证实1,25(OH)2D3对软骨细胞的增殖有明显的抑制作用，而且大剂量应用1,25(OH)2D3能够抑制小鼠生长。VDR全身敲除小鼠（VDR-/-）在发育早期阶段就出现长骨生长板肥大带异常增宽，软骨细胞排列紊乱；软骨细胞中特异性敲除（ColII-cre）VDR后，X型胶原表达明显降低。这些实验结果提示1,25(OH)2D3/VDR信号通路在软骨内成骨的调控中发挥着重要的作用。重要的是，VDR敲除小鼠的矮小表型与FGFR3功能增强型小鼠的侏儒表型相似，提示FGFs/FGFR3与1,25(OH)2D3/VDR通路之间可能存在交互作用（Crosstalk）。前期研究显示，多个蛋白可以通过与VDR蛋白直接相互作用，调控1,25(OH)2D3/VDR通路的活性与功能。结构分析发现，大部分与VDR有直接作用的蛋白质分子都含有一段保守序列，即LXXLL序列。FGFR3胞内段第705位氨基酸残基开始即为LFKLL，提示FGFR3有可能与VDR直接结合，通过调控1,25(OH)2D3/VDR通路的活性与功能，进而参与软骨内成骨的调节，但目前缺乏相关的实验证据。本研究中，我们利用组织形态学、细胞生物学、分子生物学等相关的技术与方法，研究FGFR3与VDR受体之间的交互作用及其机制，并利用体外组织培养模型初步探讨FGFs/FGFR3与VDR信号通路的交互作用在软骨内成骨中的作用及意义。主要实验方法：1. FGFR3与VDR受体分子间直接相互作用的研究采用细胞免疫荧光、免疫共沉淀等方法研究FGFR3与VDR受体之间的相互作用。1.1细胞免疫荧光实验检测FGFR3与VDR的共定位。1.2YFP-PCA荧光实验检测FGFR3与VDR的共定位。1.3检测生理条件下VDR与FGFR3内源性相互作用。1.4293T细胞中FGFR3与VDR受体间相互作用的检测。1.5通过转染不同激活形式的FGFR3表达载体，检测FGFR3的激活形式对相互作用的影响。2. FGFs/FGFR3信号通路对1,25(OH)2D3/VDR信号通路的影响2.1免疫组化检测FGFR3基因突变小鼠长骨生长板VDR受体蛋白水平的变化2.2检测FGFR3基因突变对原代软骨细胞内VDR蛋白水平的影响。2.3检测FGFR3通路的活性对VDR蛋白水平的影响（通过加入FGFR3的配体、抑制剂进行干预）。2.4外源FGFR3对胞内VDR蛋白水平的影响。2.5定量PCR检测FGFR3基因敲除对VDR转录水平的影响。2.6定量PCR检测RNAi干扰FGFR3后对VDR转录水平的影响。3.1,25(OH)2D3对FGFs/FGFR3信号通路的影响3.1通过在NIH3T3细胞中转染ERK报告基因，观察1,25(OH)2D3对ERK1/2转录的影响。3.2检测1,25(OH)2D3对软骨细胞FGFR3信号激活后磷酸化ERK1/2蛋白水平的影响。4. VDR与FGFR3受体间的相互作用对软骨发育的影响4.1MTT实验检测1,25(OH)2D3对软骨细胞增殖能力的影响。4.2利用体外组织培养模型观察1,25(OH)2D3/VDR信号通路之间的串话作用对小鼠跖骨生长的影响。主要实验结果1. FGFR3与VDR受体间存在相互作用本课题通过免疫荧光实验发现FGFR3与VDR存在共定位，然后进一步利用YFP-PCA实验证实FGFR3与VDR在细胞内有共定位，二者共同定位于细胞质靠近核的区域；通过免疫共沉淀实验证实在不同细胞系内FGFR3与VDR受体间均存在相互作用。进一步研究发现FGFR3与VDR之间的相互作用依赖于FGFR3酪氨酸激酶活性，VDR不能被失活型突变的FGFR3特异性的沉淀。2. FGFs/FGFR3信号通路对1,25(OH)2D3/VDR信号通路的影响我们通过免疫组化实验发现ACH小鼠胫骨生长板处VDR表达量降低，而FGFR3敲除后小鼠胫骨生长板处VDR表达显著增高。Western Blotting实验证实原代软骨细胞内FGFR3激活型突变能降低VDR蛋白水平，而敲除FGFR3（他莫昔芬诱导）后VDR蛋白量明显升高。通过加入FGFR3的配体FGF18、酪氨酸激酶抑制剂PD173074，从配体水平干预原代软骨细胞内FGFR3的活性状态，证实FGFR3对VDR蛋白水平的下调作用与酪氨酸激酶活性有关，这提示在生理条件下未发生突变的FGFR3受体也能通过自身活性的变化对VDR蛋白水平起调节作用；此外，通过转染不同剂量的野生型FGFR3表达载体，我们发现FGFR3对VDR蛋白水平的下调作用存在剂量依赖效应。定量PCR结果显示FGFR3不影响VDR的转录水平，提示FGFR3在转录后水平调控VDR蛋白水平，并调控VDR相关信号通路。3.1,25(OH)2D3对FGFs/FGFR3信号通路的影响双荧光素酶报告基因检测结果显示1,25(OH)2D3有效抑制由FGFR3受体活化而引起的下游信号通路的激活。此外，Western Blotting证实1,25(OH)2D3能够显著降低磷酸化ERK1/2的蛋白水平，从而对FGFs/FGFR3信号通路起负性调节作用。4. VDR与FGFR3受体间的相互作用对软骨内成骨的影响我们通过MTT实验发现1,25(OH)2D3能够抑制ATDC5细胞的增殖能力，这进一步证实VDR信号通路可能参与了对软骨内成骨的调控。此外，利用体外跖骨培养模型模拟体内软骨内成骨的过程，发现1,25(OH)2D3可有效缓解由FGFR3激活型突变引起的跖骨生长速度的延缓。主要结论：1. FGFR3与VDR受体间存在相互作用。2. FGFs/FGFR3通过与1,25(OH)2D3/VDR信号通路的交互作用，降低VDR的蛋白水平；1,25(OH)2D3能抑制FGFR3下游ERK1/2的磷酸化水平，从而相互产生负性调控作用。3.体外培养模型显示1,25(OH)2D3可缓解FGFR3功能增强所致的软骨生长抑制。