背景及目的：帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是最常见的运动障碍性疾病，65岁以上人群中帕金森病的发病率达到了1.7%。其病理特点是在大脑黑质致密部（SNc）色素性多巴胺能神经元的退行性损失，PD的发病率随着年龄增加而成进行性增高趋势，主要临床特征有静止性震颤、姿势异常、运动迟缓以及肌强直等肢体活动障碍，部分患者还伴有认知功能损害，严重影响其生活质量和社会工作。对于帕金森病目前的研究还不清楚多巴胺神经元持续丢失的原因。病因研究显示与帕金森相关的危险因素包括，遗传因素，环境因素，炎症，神经营养因子缺失以及高龄等。由于目前人口老龄化加剧，以PD为典型代表的中枢神经退行性病变已成为仅次于心脑血管疾病、恶性肿瘤和突发性脑梗塞之后的主要导致死亡的疾病，给患者及社会造成了沉重的负担。因此，探索神经系统退行性病变的具体发病机制并探寻最佳的治疗方法成为了目前神经科学研究领域的重点之一。自噬是指通过溶酶体降解细胞内的成分包括细胞器和可溶性蛋白的过程。根据运送底物至溶酶体的方式，其可以分为巨自噬，小自噬和分子伴侣介导自噬（CMA）。三种方式都可以降解可溶性蛋白质和体积较大的细胞器。保持正常稳定的自噬功能对细胞内环境的稳态非常重要。而此通路的失调已被发现在越来越多的疾病致病机制中起着重要作用，包括癌症，老年化疾病，感染性疾病，心脏疾病，神经系统疾病等。由于长寿命的神经细胞是永久分裂后细胞，所以其自噬过程特别容易受到破坏。已有研究表明自噬失调可能会引起慢性的神经变性疾病如阿尔茨海默氏病，帕金森病，亨廷顿病，以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症；还有相关的急性神经元损伤，如局部缺血和外伤中的细胞后期损伤。在中枢神经系统中的巨自噬相关基因缺失会导致退行性神经元损失。CMA和其他两种自噬代谢途径相比，，不涉及膜泡而是直接受蛋白质相互作用来调控。两个主要主要的调节因子是分子伴侣蛋白热休克70（Hsc70）和溶酶体膜受体蛋白LAMP2A来调节CMA过程。虽然帕金森病中黑质多巴胺神经元的选择性丧失的确切原因尚不完全清楚，但暴露于神经毒素及其诱导的氧化应激被认为是引起或加重疾病致病过程中的重要因素之一。同时神经生长因子MEF2D是MEF2（MEF2）家族成员之一，研究表明阻断MEF2功能明显诱导神经元死亡，而上调MEF2D表达时可促进神经元的存活。MEF2D通过调节细胞核基因转录水平和线粒体功能参与多巴胺神经元存活死亡。前期研究证明MEF2D是CMA的直接底物蛋白，CMA对保持MEF2D在神经元内正常代谢有重要的作用。已有研究显示CMA的功能失调与帕金森病的发病密切相关。前期预实验显示，帕金森相关神经毒素通过调节MEF2D降解而影响DA神经元存活，但其具体的分子机制是什么？CMA作为MEF2D主要代谢途径，如何发挥作用？本课题基于这些问题进行了研究。本研究首次从氧化应激、自噬和神经存活关键因子代谢的角度阐述了帕金森发病机制。方法：本实验选用小鼠中脑多巴胺能母细胞系SN4741用以构建帕金森细胞模型；C57BL/6小鼠大脑SNc局部注射6-羟多巴胺（6-OHDA）建立帕金森动物模型。同时还使用PD患者大脑组织进行在体实验研究。6-OHDA是一种能够最有效选择性地杀死多巴胺能神经元的神经毒素，能够使细胞和动物模型产生和帕金森病相似的病理改变。使用6-OHDA对上述两种模型进行处理后用MTT方法检测了细胞的凋亡状况，荧光素酶活性基因检测法对神经元细胞内重要转录因子MEF2D的转录活性进行检测。通过二硝基苯肼(DNP)法和生物素化碘乙酰胺（BIAM）法来检测6-OHDA诱导的氧化应激对多巴胺能神经元细胞中MEF2D的氧化修饰水平。使用化学和生物学方法调解自噬活性，以Western blot等方法检测6-OHDA调节MEF2D降解的通路，并证实自噬CMA的关键作用。高纯度提取多巴胺能细胞溶酶体，进行溶酶体结合与摄取分析观察CMA活性的改变，以及对MEF2D降解的。同时定量Real-Time PCR和免疫荧光法检测CMA关键因子水平变化。最后通过双向电泳和EMSA等方法检测PD动物模型和PD患者大脑组织MEF2D氧化修饰水平和功能变化以验证体外实验结果。结果：1.6-OHDA能够诱导MEF2D的氧化修饰并引起其转录活性与存活降低：研究表明在SN4741细胞中经6-OHDA短时间处理后引起细胞质内MEF2D水平明显降低，但对细胞核内其表达的影响不大。如果延长6-OHDA作用时间则也会降低细胞核内的MEF2D表达。之后通过免疫沉淀DNP检测法显示出在线粒体、细胞核和细胞质等不同的细胞器中，6-OHDA能够引起MEF2D氧化修饰明显增高，并与处理时间成正相关。分别转染入Flag-MEF2D Δ96，Flag-MEF2D Δ39/41，Flag-MEF2D Δ39/41/96，和pcDNA，加上野生型MEF2D进行转染,之后加入不同浓度的6-OHDA处理18h后分析显示BIAM与细胞核内MEF2D结合水平降低，表明半胱氨酸残基氧化修饰水平增加，而在突变半胱氨酸残基39，41，和96至丙氨酸则会恢复与BIAM的结合水平。从而表明这些残基对6-OHDA引起的氧化还原环境有很敏感的改变。同时EMSA检测显示随着6-OHDA处理剂量的增加，MEF2D的DNA结合力明显降低。同时我们又以抗氧化剂维生素E亚型　α-Tocopherol作用于6-OHDA处理的细胞可以降低MEF2D的氧化修饰水平。2.6-OHDA主要通过CMA途径减少SN4741细胞内MEF2D的表达：使用NH4Cl阻断CMA后能够抑制6-OHDA引起的MEF2D降低。前期研究发现在MEF2D的N末端上特定删除扩大重叠序列的18种氨基酸（Flag-MEF2DΔN18）则会阻断其与CMA的重要调节分子伴侣HSC70的结合。因此我们对MEF2D进行了N末端18种氨基酸敲除，并将这样的突变型质粒Flag-MEF2DΔN18转染入SN细胞中观察6-OHDA处理后的效果，结果显示当神经毒素能够降低野生型MEF2D表达时，对突变型MEF2DΔN18却无明显作用。其次，我们分别使用巨自噬抑制剂3-MA、UPS抑制剂MG-132以及caspase蛋白酶水解途径抑制剂z-DEVD-fmk作用于6-OHDA处理后细胞时对降低MEF2D表达并无明显抑制作用。因此说明6-OHDA主要通过CMA途径来影响MEF2D的代谢。3.6-OHDA能够激活多巴胺能SN4741细胞的CMA降解途径：6-OHDA处理SN细胞16h后，溶酶体与CMA的一个敏感底物蛋白核糖核酸酶A（RNaseA）的结合明显增高。同样，6-OHDA也能引起溶酶体对RNaseA的摄取增加。定量Real-Time PCR和免疫荧光显示SN细胞经过6-OHDA处理4h后，LAMP-2AmRNA或蛋白本身表达水平明显增加。通过转染过表达antisense-LAMP2A从而减少细胞内LAMP2A水平，结果显示会抑制由6-OHDA引起的MEF2D表达量的减少。同时检测显示6-OHDA处理SN细胞后并没有明显改变HSC70的表达水平。4. CMA能够促进6-OHDA引起氧化修饰后MEF2D的降解：以NH4Cl抑制CMA后，氧化修饰的MEF2D表达明显增高，同时以antisense-LAMP2A减少细胞内LAMP2A水平后，氧化修饰的MEF2D表达会相应增加。同时实验显示6-OHDA还能够明显提高MEF2D与GST-Hsc70的结合能力，而免疫共沉淀反应（Co-IP）也显示MEF2D与Hsc70相互作用明显增加。对溶酶体摄取检测显示6-OHDA处理后溶酶体对被氧化的MEF2D摄取增加了。说明6-OHDA产生的氧化应激作用能够增强MEF2D与Hsc70的结合，从而促进其在溶酶体内的降解。5. PD动物模型和PD患者脑组织中存活因子MEF2D氧化修饰水平增高：通过立体定向单侧注射6-OHDA于小鼠黑质致密部（SNc）成功建立了PD小鼠模型。我们还获取了空白对照组和帕金森患者去世后尸检后大脑纹状体组织标本。之后通过DNP法检测发现PD小鼠模型和PD患者脑组织MEF2D氧化修饰水平较对照组明显增高。双向电泳氧化分析显示PD动物模型与PD患者大脑组织MEF2D的PI值明显增加，拖尾加长，分子结构改变，PI值7.6附近结构亚型的羟基化水平明显增高。并且动物模型与PD患者MEF2D与DNA结合能力也同样降低。同时实验还显示在PD模型小鼠脑组织中LAMP2A表达增加但Hsc70的变化并不明显，这与之前体外细胞实验结果是一致的。结论：本研究通过综合应用形态学、分子生物学、免疫学等多种研究方法，首次从体外和体内实验多个角度论证了神经毒素6-OHDA调节多巴胺神经元重要活性转录因子MEF2D从而影响神经元细胞活性的分子机制。揭示了核因子、氧化应激和存活死亡调节的具体机制：氧化MEF2D本身和激活分子伴侣介导的自噬，加速了MEF2D的降解。该调节通路为神经毒素及氧化应激诱导的毒性作用于多巴胺神经元具体机制提供了新的理论依据，同时也为帕金森病的临床治疗提供了新思路。