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目的构建并筛选小鼠组蛋白乙酰化酶(histone acetylase, HATs)亚型p300的特异性RNA干扰(RNA interference, RNAi)载体,为进一步研究p300对胚胎心脏发育相关基因的时空调控,及p300介导的组蛋白乙酰化修饰对心脏发育的影响奠定基础。方法针对小鼠p300基因的保守序列区域设计并构建三个重组质粒p300RNAi1,p300RNAi2和p300RNAi3。利用阳离子脂质体将其分别转染入小鼠C3H10T1/2细胞,利用RT-PCR和细胞免疫荧光方法分别从mRNA和蛋白水平检测p300表达,分析p300RNAi载体的抑制效率。结果RT-PCR和细胞免疫荧光分析结果均显示,转染阴性对照载体pSOS-HUS和p300 RNAi2载体的细胞与正常组比较,p300表达无明显变化(P>0.05),而转染p300 RNAi1和p300 RNAi3的细胞内p300比正常组表达水平降低(P<0.05)。结论小鼠p300特异性RNAi质粒载体构建成功,p300RNAi1和p300RNAi3可以有效抑制p300的表达。目的由于目前技术限制,难以通过母体实现胚胎心脏组织中靶基因的RNAi,故本研究拟选取p300特异性小分子化学抑制剂姜黄素(Curcumin)来替代胚胎心脏p300的RNAi,实现胚胎心脏发育过程中组蛋白低乙酰化。本部分实验目的为,研究姜黄素对体外培养的小鼠原代心肌细胞中HATs活性以及组蛋白乙酰化修饰状态的影响,并筛选最佳干预浓度和最佳干预时间。方法体外培养原代心肌细胞,分别用不同浓度(10μM、20μM、30μM、40μM和50μM)的姜黄素干预,并在不同时间点(6h、12h、24h、36h和48h)收获细胞,提取核蛋白,ELISA方法检测心肌细胞中HATs活性,Western Blot方法检测组蛋白H3的乙酰化修饰水平。结果ELISA和Western Blot分析结果显示,姜黄素可以抑制心肌细胞中HATs活性和组蛋白H3乙酰化修饰,且存在一定时间、剂量依赖性。当姜黄素浓度低于30μM,作用时间短于24h时,心肌细胞中HATs活性无明显改变; 30μM姜黄素作用24h后,心肌细胞中HATs活性与对照组比较明显降低(0.37±0.10 vs 0.94±0.28,P<0.05),组蛋白H3乙酰化修饰水平亦较对照组明显下降(0.77±0.36 vs 2.99±1.10,P<0.05),但浓度超过40μM时,细胞死亡明显增加,而30μM作用时间超过48h后,心肌细胞中HATs活性则开始恢复。结论姜黄素可以有效抑制原代心肌细胞中HATs活性和组蛋白H3乙酰化修饰水平,最佳干预条件为30μM作用24h。目的研究姜黄素诱导的组蛋白低乙酰化对体外培养心肌细胞中核心转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c表达的影响,并探讨其影响机制。方法体外培养原代心肌细胞,用姜黄素处理细胞(30μM,24h)后,利用real time RT-PCR检测心脏发育核心转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c的表达水平,并利用乙酰化H3特异性抗体做染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP),针对GATA4、Nkx2.5和Mef2c启动子区域设计引物进行real time PCR,分析基因启动子区域的组蛋白乙酰化水平。同时实验中选择明确受p300介导组蛋白乙酰化调控的基因α-skeletal actin作为阳性对照,而表达不依赖于组蛋白乙酰化修饰调控的核糖体蛋白L13A(riosomal protein L13A, RPL13A)作为阴性对照。结果(1) real time RT-PCR结果显示,经姜黄素处理后,心肌细胞中GATA4(0.34±0.07)、Nkx2.5(0.57±0.11)、Mef2c(0.26±0.04)的表达较对照组(分别为0.87±0.11、1.03±0.23和0.76±0.14)明显降低(P<0.05)。同时,阳性对照α-skeletal actin的表达(1.02±0.05)也较对照组(2.00±0.11)明显降低(P<0.05),而阴性对照RPL13A的表达(1.13±0.03)与对照组(1.11±0.03)比较则没有显著变化。(2) ChIP-PCR分析结果显示,姜黄素组心肌细胞中,GATA4(1.75±0.67)、Nkx2.5(1.29±0.40)、Mef2c(2.13±0.99)和α-skeletal actin(2.68±0.05)启动子区域的组蛋白乙酰化水平较对照组明显降低(P<0.05),而RPL13A启动子区域组蛋白乙酰化水平无明显改变。结论(1)姜黄素引起的组蛋白低乙酰化可致原代心肌细胞中核心转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c的表达降低。(2)基因启动子区域组蛋白乙酰化修饰水平降低,可能是组蛋白低乙酰化致GATA4、Nkx2.5和Mef2c表达降低的机制之一。目的研究小鼠胚胎心脏发育期间组蛋白乙酰化失衡对心脏发育的影响,并探讨其机制。方法在小鼠胚胎心脏发育的特定时间(E7.5~E16.5)对孕鼠进行姜黄素腹腔注射(50、75、100、150mg/kg·d),诱导组蛋白低乙酰化模型,在胚胎心脏发育不同时间点(E11.5、E14.5、E17.5)取胚胎心脏,分别利用HE染色、ELISA、Western Blot和real time RT-PCR技术分析胚胎心脏结构、胚胎心脏组织的HATs活性、组蛋白H3乙酰化修饰水平,以及核心转录因子的表达。结果(1)姜黄素干预孕鼠后,E11.5、E14.5和E17.5胚胎心脏组织的HATs活性、组蛋白乙酰化水平较对照组明显降低。(2) E11.5实验组胚胎心脏体积较对照组小,心室壁厚度变薄,心室小梁和室间隔发育较对照组滞后;E14.5实验组胚胎心脏室间隔完整,但心室壁、室间隔厚度均较对照组变薄,心室肌小梁形成减少;E17.5实验组胚胎心脏结构基本正常,心室壁、室间隔厚度较对照组稍薄,心室肌小梁少于对照组。(3) E11.5和E14.5实验组胚胎心脏组织中GATA4、Nkx2.5和Mef2c的表达均较对照组明显降低(P<0.05),而E17.5,胚胎心脏组织中GATA4和Nkx2.5的表达较对照组降低(P<0.05),但Mef2c表达与对照组比较差异无统计学意义。结论(1)组蛋白低乙酰化模型中,早期胚胎心脏发育滞后于对照组,后期虽能完成发育,但心室壁变薄,肌小梁生成减少。(2)胚胎心脏发育早期,组蛋白低乙酰化可以导致核心转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c表达降低,这可能是组蛋白低乙酰化引起胚胎心脏发育异常的机制之一。(3)胚胎心脏发育早期,组蛋白低乙酰化可引起Mef2c表达降低,但后期Mef2c的表达基本恢复正常,提示体内存在多种基因调控方式,可能通过某种保护机制相互代偿。(4)心脏发育核心转录因子Mef2c的表达在后期恢复正常,这也可能是胚胎心脏在后期能完成基本发育的基础之一。