目的:印度黄檀Dalbergia sissoo Roxb.为豆科Leguminosae黄檀属Dalbergia植物,是热带及亚热带常绿阔叶树种,其树干心材曾作为中药降香使用。印度黄檀枝叶茂盛,生长速度快,但至今未见印度黄檀叶化学成分及综合利用的研究报道。为探索印度黄檀叶的药用价值,综合开发利用印度黄檀资源,作者对其进行了生药学、药理学、中药化学、分析化学方面的综合研究。方法:依据形态学特征对印度黄檀叶进行原植物形态描述,依性状鉴别法进行组织性状鉴别,用石蜡切片法制作石蜡切片,用显微鉴别法对石蜡切片、表皮制片及粉末进行显微特征鉴别。以KM小鼠为实验模型,以抗凝血、抗炎、镇痛为实验指标,对印度黄檀叶不同极性部位进行药效学筛选。采用柱层析法、溶剂法、重结晶等方法对印度黄檀叶醇水提取物进行化学成分分离纯化,并经理化常数、质谱和1H-NMR、13C-NMR等光谱分析,对所分离的成分进行结构鉴定;按照2010版中国药典一部附录ⅥB薄层色谱法试验,采用TLC法对印度黄檀叶进行薄层色谱鉴别;以鹰嘴豆芽素A为对照品,采用紫外分光光度法测定印度黄檀叶中总异黄酮含量,并运用正交设计法优化印度黄檀叶中总异黄酮提取工艺:采用UPLC法同时测定印度黄檀心材、叶、花、果实、树皮等各个部位鹰嘴豆芽素A的含量;采用HPLC法对印度黄檀叶不同产地及不同月份的指纹图谱进行比较研究,并构建印度黄檀叶HPLC指纹图谱。结果:1.印度黄檀叶形状、切片及显微特征形状特征为:叶片卵形或椭圆形,先端急尖,钝头,基部圆形或楔形,长4～7cm,宽2～3cm,叶柄长1.5～3cm;生品上表面深绿色,下表面绿色;晒干品呈浅绿色;叶片近革质,纸质或薄革质,表面较光滑;气微香,味微苦。显微鉴别要点概括为:(1)叶横切面观:维管束外韧型,射线细胞、韧皮部细胞和侧脉维管束部位含较多的草酸钙柱晶或方晶;两面叶,栅栏组织与海绵组织的分化明显;(2)叶表面观:叶片表面光滑,气孔主分布于叶片下表皮,主为平轴式及不定式;有众多黄色非腺毛;下表皮气孔指数为15.2%～17.6%,脉岛数为7～10个/mm2;(3)粉末:可见众多晶纤维及纤维,晶纤维有的呈分枝状;草酸钙柱晶及方晶多存在于薄壁组织细胞中,可见韧皮纤维和木纤维单个散在;非腺毛由两个细胞组成,靠近头部的细胞较短,较大的细胞颜色较深,壁疣明显;导管主为螺纹。2印度黄檀叶不同极性部位药效学研究印度黄檀叶70%乙醇提取物经过萃取,得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇四个部位;对印度黄檀叶不同极性部位进行药效学研究结果显示:抗凝血试验中,各实验组均可不同程度的延长凝血时间,给药组与对照组相比给药前后凝血时间差异进行t检验,其中正丁醇组和石油醚组的P值均小于0.05,有显著性意义。抗炎实验中,各实验组除石油醚组外均有不同程度的减轻小鼠耳肿胀的作用,给药组与对照组给药前后小鼠耳肿胀抑制率进行t检验,其中氯仿组P值小于0.05,有显著性意义;乙酸乙酯组P值小于0.01,有极显著性意义。镇痛实验中,各实验组均有不同程度的镇痛作用,均能延长小鼠疼痛潜伏期,减少扭体次数,对各给药组与对照组给药前后小鼠扭体次数差异进行t检验,其差异P值均小于0.05,有显著性意义;乙酸乙酯组P值小于0.01,有极显著性意义。3.印度黄檀叶的质量评价3.1印度黄檀叶化学成分研究印度黄檀叶中含有氨基酸、蛋白质、有机酸、酚类、糖类、三萜类、黄酮类、挥发油等类化合物。从印度黄檀叶中分离得到六个化合物,经鉴定,分别为鹰嘴豆芽素A(Biochanin A)、1,3-二羟基-6-甲氧基-9H-咕吨-9-酮(1,3-Dihydroxy-6-methoxy-9H-xanthen-9-one)、鹰嘴豆芽素A7-O-[β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖、鹰嘴豆芽素A7-0-[β-D-呋喃芹糖-(1→5)-β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖]、槲皮素3-0-β-D-葡萄糖苷、芦丁。3.2.印度黄檀叶总异黄酮含量测定方法建立及提取工艺优化确定印度黄檀叶总黄酮提取最佳工艺为:70%乙醇提取,提取时间30 min,料液比1:200,提取次数2次;采用紫外分光光度法,测得最佳总黄酮提取工艺下印度黄檀叶中总异黄酮含量为30.041±0.28mg/g,RSD为0.93%。3.3印度黄檀叶薄层鉴别以鹰嘴豆芽素A、鹰嘴豆芽素A 7-0-[β-D-呋喃芹糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖等为对照品,365nm紫外灯下,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,有相同颜色的斑点。3.4印度黄檀各个部位鹰嘴豆芽素A的含量测定鹰嘴豆芽素A分别在浓度0.017～502μ g范围内呈良好的线性关系(r=0.9998),平均加样回收率为99.02%。各部位鹰嘴豆芽素A的含量比较:印度黄檀花>心材>叶>果实≈边材>树皮,树皮中鹰嘴豆芽素A含量较低,有时难以检出。印度黄檀花中鹰嘴豆芽素A含量远高于叶中,因而在进行叶子的综合开发利用时,也可以考虑对花进行开发利用,增强印度黄檀资源的可持续性利用。3.5印度黄檀叶指纹图谱经相似度软件分析后确定15个共有峰为特征峰,构成印度黄檀叶药材HPLC指纹图谱,其中有五个特征峰得到确认。19批样品中有15个批次的HPLC指纹图谱相似度大于0.8,其余4个批次的HPLC指纹图谱相似度介于0.39-0.8之间,19批样品共有指纹峰全部出现且相对保留时间RSD(%)均小于1%,非共有峰占总峰面积均小于10%,说明本实验共有峰的选择合理、实验方案稳定,可行。3.6印度黄檀叶不同产地、不同月份质量比较将不同产地、不同月份的叶中六个主要成分进行比较,发现广州中医药大学药王山的印度黄檀叶质量优于湛江南药试验场和化州;不同月份的叶几种主要成分的变化都有一定的规律。印度黄檀不同部位指纹图谱相似度较低,心材成分较其他部位差异较大,心材的色谱峰基本集中在15～22min,而叶子、枝、花、果实等部位的色谱峰分布较为均匀,并且从其指纹图谱色谱峰的紫外吸收光谱图可以看出,心材的成分与其他部位差异较大。在挑选共有峰时也发现心材与其他部位共有峰较少,只有鹰嘴豆芽素A较为明显。剔除心材后,将其他部位进行比较,结果发现果实相似度较低,其他部位相似度较高。结论:印度黄檀叶的形态学特征及表皮、横切面、粉末显微等特征,能够有效地对印度黄檀叶进行生药学鉴定。印度黄檀叶石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇四个部位均具有抗凝血、抗炎、镇痛作用,其中抗凝血药效的主要部位是正丁醇部位和石油醚部位,抗炎药效的主要部位是乙酸乙酯和氯仿部位,镇痛药效的主要部位是乙酸乙酯、正丁醇、氯仿部位,实验结果均具有统计学意义,尤其乙酸乙酯和正丁醇部位具有较强的药理作用,是后续对印度黄檀叶开发的重点部位。印度黄檀叶乙酸乙酯和正丁醇部位主要成分为黄酮类成分,以鹰嘴豆芽素A等异黄酮类为主,在已分离的6个化合物当中,有3个为异黄酮类,2个黄酮类,1个蒽酮衍生物类;该叶中总黄酮最佳提取工艺下测得印度黄檀叶中总异黄酮含量为30.041±0.28mg/g,说明印度黄檀叶中总黄酮含量较高,该提取工艺简单、稳定,有利于印度黄檀叶的综合开发利用。UPLC法对印度黄檀不同部位的鹰嘴豆芽素A含量测定的方法具有快速、稳定等特点,测定结果表明,鹰嘴豆芽素A在印度黄檀花中的含量最高,叶中含量与已结香的心材接近,因此开发潜力较大。结合形状与显微鉴别、薄层鉴别、含量测定、指纹图谱的现代分析手段,可较好地建立印度黄檀叶的质量评价体系。