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种子休眠和萌发是植物对环境变化的适应特征,种子萌发是非常复杂的生理过程,受到内源因子和外部环境因子的共同调控。调控种子萌发的主要激素是赤霉素和脱落酸,其中赤霉素破除休眠,促进萌发,而脱落酸抑制萌发,维持休眠,种子最终是否萌发取决于种子里赤霉素和脱落酸的浓度比。光照和温度是影响种子萌发的最关键的两个环境因子,光照和低温层积作为一种环境刺激可以破除种子休眠,促进萌发。目前人们已对种子萌发响应光照和温度的分子机理进行了大量长期深入的研究,鉴定出了一些参与种子萌发中光信号传递途径和温度信号途径的关键基因,对种子萌发的分子机理也有了一些初步的了解。本研究以我们实验室的前期研究工作为基础,结合数据库的信息,挖掘了几个可能参与调控种子萌发响应光照和温度的基因,运用遗传学和分子生物学的实验手段分析这些基因的组织表达特征,与赤霉素和脱落酸的相互作用关系及在种子萌发响应光照和温度及胁迫中的作用,并通过基因克隆和转基因的方法验证了基因的功能。主要研究结果如下：1.运用qRT-PCR和组化染色分析了FAE1基因的组织表达特征,发现FAE1主要在发育的角果和萌发的种子里表达,萌发实验发现fae1突变体萌发时间比野生型稍快,表明FAEl基因可能是调控种子萌发的负向调控因子。激素诱导实验发现FAE1表达受GA抑制。新成熟的fae1突变体种子休眠度比野生型低,对低温春化处理的敏感性低于野生型,通过构建过量表达株系和RNAi干扰株系,进一步验证该结论。qRT-PCR分析发现低温春化下调FAE1的转录水平,表明低温春化可能通过抑制FAE1来解除种子休眠。在萌发的种子里,FAE1的表达受SPT下调,推测低温处理通过SPT抑制FAEl的途径来解除FAE1对种子萌发的抑制。qRT-PCR分析发现FAE1抑制GA合成代谢基因GA3ox1,GA3ox2. GA20ox1,GA20ox2,GA20ox3及ABA分解代谢基因CYP707A2的表达,表明FAE1可能通过抑制GA合成和ABA分解来维持种子休眠。种子萌发的胁迫实验发现FAE1突变导致种子萌发对胁迫不敏感,而FAE1过量表达则增强了种子对胁迫的敏感性,表明FAE1能够降低种子对胁迫的耐受性,而且胁迫处理能够诱导FAE1的表达,因此盐胁迫和渗透胁迫可能通过上调FAE1的表达抑制种子萌发。2.qRT-PCR和GUS染色分析发现EXP2特异表达于萌发的种子和胚根中,EXP2在种子吸涨之后24h表达量到达峰值。GA和ABA诱导实验发现EXP2的表达受GA上调,但不受ABA影响。通过对DELLA突变体进行qRT-PCR分析发现RGA,GAI,RGL1,RGL2都对EXP2的表达有抑制作用,其中RGL1的抑制作用最大。萌发实验中发现EXP2突变导致种子萌发延迟,表明EXP2参与了种子萌发过程,PAC处理实验表明还有其他因子调控EXP2,即EXP2除了受GA调控来促进种子萌发,还以不依赖于GA的方式参与调控种子萌发。在盐胁迫和渗透胁迫下,野生型、突变体、过量表达株系和RNAi株系萌发率都受到抑制,exp2突变体对胁迫更为敏感,而过量表达株系敏感性较低,表明EXP2的过量表达可以提高种子对胁迫的耐受性,而qRT-PCR分析发现胁迫处理抑制EXP2的表达,表明盐胁迫和渗透胁迫通过抑制细胞壁松弛蛋白编码基因的转录活性来抑制种子萌发。3.通过检索数据库发现PIL5基因存在可变剪切,一个是缺失APB基序的剪切体,命名为PIL5α；一个是包含完整CDS的剪切体,命名为PIL5β, qRT-PCR分析发现萌发种子中这两个剪切体都有表达,PIL5β表达水平略高于PIL5α。通过分别构建PIL5α过量表达载体和PIL5β过量表达载体并转化拟南芥得到过量表达转基因株系,萌发实验显示光照下缺失APB基序的PIL5α参与抑制种子萌发,表明PIL5的功能结构域主要与bHLH有关。全长CDS剪切体PIL5β过量表达株系在光照下萌发率仍低于野生型,推测光敏色素与PIL5的结合能力有限。光照加低温春化处理下PIL5α和PIL5β过量表达株系萌发率都接近100%,表明光信号途径除了通过降解PIL5蛋白促进萌发,可能还有其他因子参与其中,并且可能在PIL5的翻译水平上存在负向调控导致PIL5蛋白不能正常积累。4.以SPT突变体(Spt-1,spt-2.spt-3),phyB-1突变体及两者的双突变体为材料在光照处理和低温处理下观察它们的萌发表型,发现在光照条件下,SPT突变体低萌发率的表型在SPT和PhyB的双突变体中恢复到接近野生型的水平,表明SPT对种子休眠的调控依赖于PhyB的作用,qRT-PCR分析发现与spt-2单突变体相比,双突变体种子中有较低的ABA代谢活性及信号通路活性和较高的GA代谢活性,表明SPT与PhyB对种子萌发的调控通路汇聚到对ABA和GA代谢水平和信号通路的调控上。通过本文的研究,我们可以加深了解种子萌发响应光照和温度的分子机理,为深入了解种子萌发的生理生化特征及解析种子萌发的基因调控网络积累了实验依据,并对我们掌握种子萌发的规律并在未来应用于提高种子农艺性状具有重要的理论意义和实际应用价值。