研究目的：基于皮层脑电图的描记与分析,探讨Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠模式；在此基础之上,探究合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠模式改变的作用及机制研究。研究方法：第一部分、Period3基因敲除型纯合子小鼠的繁育与子代鼠的基因鉴定分别取遗传背景为C57BL/6J的Period3基因敲除型杂合子(Per3+/-)小鼠及野生型纯合子(Per3+/+)小鼠各2只(2雄2雌)进行饲养。小鼠8周大时,分别将相同基因型的雌雄小鼠各一只配对育种。小鼠在遮光,通风,可控温度和湿度的设备中繁殖。自由饮食饮水,12：12-h明暗交替。第四代断奶后,收集尾部进行基因鉴定。将小鼠尾部组织小段(长约0.3～0.5 cm)进行基因组DNA的提取、PCR反应及琼脂糖凝胶电泳鉴定。分别将鉴定出的第四代Period3基因敲除型纯合子小鼠和野生型小鼠进行育种配对,以繁殖实验用小鼠。第五代断奶后,再收集尾部组织进行PCR基因鉴定,以确保小鼠基因型的稳定。第二部分、Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠模式及机制的初步研究一、Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠结构的研究分别取雄性Period3基因敲除型纯合子小鼠作为基因敲除组(Per3--组),雄性野生型小鼠作为空白对照组(WT组),每组各8只。两组小鼠适应实验环境一周后,进行小鼠皮层脑电电极和肌电电极的埋置。小鼠回复7天后描记小鼠EEG/EMG5天(120小时)。描记结束后,使用SleepSign 2.0分析。以10秒为一个单元分析EEG和EMG信号判断觉醒(wake).NREM睡眠和REM睡眠,并用Excel 2010绘制睡眠时相序列图(hypnogram)。二、Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠觉醒时相的研究分别取雄性Period3基因敲除型纯合子小鼠作为基因敲除组(Per3-/-组),雄性野生型小鼠作为空白对照组(WT组),每组各8只。两组小鼠适应实验环境一周后,进行小鼠皮层脑电电极和肌电电极的埋置。小鼠回复7天后描记小鼠EEG/EMG 5天(120小时)。描记结束后,使用SleepSign 2、0分析。以10秒为一个单元分析EEG和EMG信号。分别计算各时期(觉醒、NREMS.REMS)的持续时间,分别计算每小时的觉醒及各个睡眠时相所占的百分比；分别计算5天的觉醒及睡眠各时相平均成一天内的每小时各个时相的持续时间百分比；分别计算每12小时时段(白天-夜间)的觉醒及各睡眠时相；分别计算每小时、每12小时(白天-夜间)的总睡眠次数,并将5天的每一小时的睡眠次数平均为24小时每小时的睡眠次数,以及白天时段-夜间时段的睡眠总次数；使用S1eepSign 2.0分析NREM睡眠期EEG的6波能量,计算每一小时NREMS δ波的能量及同天24 h NREM睡眠平均的δ波能量(计算成100%的δ波活动),将二者相比,计算出每小时6波活动的所占比例。三、Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠时间的研究分别取雄性Period3基因敲除型纯合子小鼠作为基因敲除(Per3-/-)组,雄性野生型小鼠作为空白对照组(WT),每组各8只。两组小鼠适应实验环境一周后,进行小鼠皮层脑电电极和肌电电极的埋置。小鼠回复7天后描记小鼠EEG/EMG 5天(120小时)。描记结束后,使用SleepSign 2.0分析。以10秒为一个单元分析EEG和EMG信号。分别计算每小时的NREMS/总睡眠所占比例的百分比,每小时的REMS/TS所占比例的百分比,每12小时(分白天-夜间)的NREMS/TS及REM/TS所占比例。四、Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠模式变化机制的初步研究取Period3基因敲除型纯合子小鼠及野生型小鼠各16只,每种基因型小鼠随机分为4组,每组4只小鼠,适应实验环境7天后,于第8天7：00开始,每6小时取小鼠下丘脑,每次分别取Period3基因敲除型纯合子小鼠及野生型小鼠各一组。之后进行每个时间点Period3基因敲除型纯合子小鼠及野生型小鼠下丘脑RNA与qRT-PCR的抽提实验以检测AVP及DBP基因的表达。第三部分、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠模式及机制影响的初步研究一、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠结构的影响取16只雄性Period3基因敲除型纯合子小鼠,经皮层脑电电极和肌电电极的埋置手术处理,恢复7天后,将小鼠随机分为给药组及空白对照组,每组各8只。灌胃给予给药组小鼠合欢花水煎液O.1mL/10g(10 g/kg),灌胃给予空白组小鼠相同体积的蒸馏水,连续给药7天,第7天早7：00进行给药组及空白对照组小鼠的脑电及肌电描记实验。经3天(72小时)持续描记EEG/EMG后,以10秒(sec)为一个单元进行EEG和EMG信号的分析,判断觉醒(wake)、NREM睡眠和REM睡眠,并绘制睡眠时相序列图(hypnogram)。二、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠觉醒时相的影响研究取16只雄性Period3基因敲除型纯合子小鼠,经皮层脑电电极和肌电电极的埋置手术处理,恢复7天后,将小鼠随机分为给药组及空白对照组,每组各8只。灌胃给予给药组小鼠合欢花水煎液0.1 mL/10 g (10 g/kg),灌胃给予空白组小鼠相同体积的蒸馏水,连续给药7天,第7天早7：00进行给药组及空白对照组小鼠的脑电及肌电描记实验。经3天(72小时)持续描记EEG/EMG后,以10秒(sec)为一个单元进行EEG和EMG信号的分析。分别计算各时期(觉醒、NREMS、REMS)的持续时间。同时分别计算每小时的觉醒及各个睡眠时相所占的百分比。分别计算3天的觉醒及睡眠各时相平均成一天内的每小时各个时相的持续时间百分比。分别计算每12小时时段(白天-夜间)的觉醒及各睡眠时相。分别计算每小时、每12小时(白天-夜间)的总睡眠次数,并将3天的每一小时的睡眠次数平均为24小时每小时的睡眠次数,以及白天时段-夜间时段的睡眠总次数。使用SleepSign 2.0分析NREM睡眠期EEG的δ波能量,计算每一小时NREMS δ波的能量及同天24 hNREM睡眠平均的δ波能量(计算成100%的6波活动),将二者相比,计算出每小时δ波活动的所占比例。三、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠时间的影响研究取16只雄性Period3基因敲除型纯合子小鼠,经皮层脑电电极和肌电电极的埋置手术处理,恢复7天后,将小鼠随机分为给药组及空白对照组,每组各8只。灌胃给予给药组小鼠合欢花水煎液0.1m L/10 g (10 g/kg),灌胃给予空白组小鼠相同体积的蒸馏水,连续给药7天,第7天早7：00进行给药组及空白对照组小鼠的脑电及肌电描记实验。经3天(72小时)持续描记EEG/EMG后,以10秒(sec)为一个单元进行EEG和EMG信号的分析。分别计算每小时的NREMS/总睡眠所占比例的百分比,每小时的REMS/TS所占比例的百分比,每12小时(分白天-夜间)的NREMS/TS及REM/TS所占比例。四、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠模式变化影响机制的初步研究取雄性Period3基因敲除型纯合子小鼠16只,随机分为给药组及空白对照组,每组各8只。适应环境7天后,灌胃给予给药组小鼠合欢花水煎液0.1 mL/10 g(10g/kg),灌胃给予空白对照组小鼠同体积的蒸馏水,灌胃时间为每天早7：00,每组连续给药7天,于第7天给药2小时后将小鼠断头取脑,大脑取出后置于冰板上并剥离出下丘脑,于-80℃冰箱中保存。最后,进行抽提RNA与qRT-PCR实验检测AVP和DBP基因的表达。实验结果：第一部分、Period3基因敲除型纯合子小鼠的繁育与子代鼠的基因鉴定通过PCR基因鉴定表明,自行繁殖的Period3基因敲除型纯合子(Per3-/-)小鼠及野生型纯合子(Per3+/+)小鼠有稳定的基因型。通过饲养观察,每种基因型小鼠的表型、子代生产量、生长、存活率均是正常的。第二部分、Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠模式及机制的初步研究一、Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠结构的研究野生型小鼠与Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠觉醒节律及结构相似。通过睡眠时相序列图可以看出开灯后,两种基因型之间的睡眠清醒状态有些差异,但大部分的时间两种基因型小鼠的睡眠结构看不出明显的差异。二、Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠觉醒时相的研究与野生型小鼠相比,每天第一小时(ZTO)PPeriod3基因敲除型纯合子小鼠清醒时间的百分比较多,NREM睡眠时间少,两者间具有显著差异，Period3基因敲除型纯合子小鼠入睡延迟；大部分白天时间,Period3基因敲除型纯合子小鼠的REM睡眠较多,但没有显著性差异；5天的各个清醒睡眠参数平均成1天的结果显示与5天的结果有相似；分别计算睡眠时相所占比例后可以看出,与野生型小鼠相比,Period3基因敲除型纯合子小鼠的清醒时间较多、睡眠时间减少、NREM睡眠较少、白天的REM睡眠较多,但没有显著性差异；与野生型小鼠相比,Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠片断在开灯后第一小时(ZTO)较少；同时ZT0 NREM的δ活动较少,具有显著差异；与野生型小鼠相比,Period3基因敲除型纯合子小鼠在夜初时睡眠时间较多,同时NREM的6波活动也较多,但都无显著性差异。三、Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠时间的研究与野生型小鼠相比,Period3基因敲除型纯合子小鼠的总体睡眠时相、时间、以及所占比例无变化,两者间没有显著性的差异；与野生型小鼠相比,Period3基因敲除型纯合子小鼠在白天有些时间点的NREMS/TS较少、REMS/TS较多；在夜晚初时,Period3基因敲除型纯合子小鼠的NREMS/TS及REMS/TS匕野生型小鼠有增多的趋势,有些时间点REM睡眠有显著差异。在睡眠中明显的是白天的NREMS/TS所占比例较少,具有显著差异。Period3基因敲除型纯合子小鼠的REM睡眠有增多的趋势,但没有显著性的差异。四、Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠模式变化机制的初步研究与野生型鼠相比,Per3基因敲除鼠的A VP基因表达模式有表达量较高的趋势,在夜间ZT 12及ZT18点AVP表达水平具有显著差异(P<0.05)。并且Per3基因敲除小鼠的AVP表达节律无显著性的延迟差异。Per3基因敲除小鼠的D6p基因表达模式与野生型鼠相比,在ZT18点的D6p表达水平较低具有显著差异(P<0.05),表达节律有无明显的前进趋势。第三部分、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠模式及机制影响的初步研究一、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠结构的影响研究以10秒为一个单元,描绘清醒、NREM睡眠及REM睡眠标成睡眠时相序列图。通过睡眠时相序列图可以观察到有些给药组小鼠的睡眠觉醒节律及结构与空白组有差异,睡眠状态增加,有些小鼠REM睡眠减少。二、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠觉醒时相的影响研究与空白组相比,给药组小鼠在日初时的觉醒所占比例减少,NREM睡眠所占比例增加,REM睡眠的所占比例无变化。连续三天的结果表明,合欢花水煎液有改善Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠节律的作用。与空白组相比,给药组白天的NREM睡眠所占比例增加,两者间存在显著差异,但给药组白天的NREM δ活动无显著差异；与空白组相比,给药组小鼠睡眠次数增加,NREM睡眠时间增加,清醒时间减少,而NREM的6波活动无变化；第3天的夜间结果显示,与空白组相比,给药组小鼠的清醒时间比第1天增多,但两者间无显著差异。三、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠时间的影响研究与空白组相比,给药组小鼠每小时的NREMS/TS增加,REMS/TS减少,但大部分无显著性的差异；与空白组相比,给药组小鼠白天ZTO的NREMS/TS比例增加,两者间存在显著差异；与空白组相比,给药组在夜晚初的NREMS/TS及REMS/TS比例都增多,但两者间无显著性差异。与空白组相比,给药组小鼠第2天的白天NREMS/TS所占比例增加,第1天的白天REMS/TS所占比例减少。此外,将3天的实验结果平均成1天表明,与空白组相比,给药组白天的NREMS/TS所占比例增加。四、合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠模式变化影响机制的初步研究与空白组相比,给药组小鼠下丘脑中DBP基因表达水平升高,两者间具有显著性差异；与空白组相比,给药组小鼠下丘脑中AVP基因表达水平升高,但两者间无显著性差异。实验结论：1.Period3基因敲除型纯合子小鼠在白天第一小时觉醒时间较多NREM睡眠时间及NREM δ波活动较少,入睡较晚。白天的清醒时间及REM睡眠较多、NREM睡眠较少。2.Period3基因的作用机制可能是有关生物钟基因与行为活动的激发驱动相互作用,以响应明暗周期,及下丘脑中Period3基因调控AVP基因表达有关。3.合欢花水煎液对Period3基因敲除型纯合子小鼠的睡眠模式有影响,具体表现在合欢花水煎液减少Period3基因敲除型纯合子小鼠日初的清醒时间,增加NREM睡眠时间,使小鼠入睡更早。减少12小时白天-夜晚的清醒时间,以及增加NREM睡眠时间及白天NREMS/TS所占比例。4.合欢花水煎液能够增加小鼠下丘脑的D6p基因表达水平,这可能是合欢花水煎液改变Period3基因敲除型纯合子小鼠睡眠模式的机制之一。