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噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus,以下简称蛭弧菌)是一类以黏附、裂解宿主菌方式使自身得以生长繁殖的微生物,广泛存在于各种自然水体。论文试验期间在海南对当地方斑东风螺、南美白对虾、九孔鲍鱼、斜带石斑鱼、点带石斑鱼、锯缘青蟹的育苗池和养殖池,绿藻藻池以及养殖区周边的海域和远离养殖区的外海海域进行海水微生物环境调查;同时对黄浦江河水、生活污水及上海沪东污水处理厂水样进行淡水微生物环境调查。调查结果发现所有被检测水域均有噬菌蛭弧菌的存在,数量在10<1>~10<3> pfu/ml不等,表现为与水体中细菌总数、弧菌数成正相关。
从海南琼海对虾养殖场及其周边排水沟采集水样,比较不同分离方法、上层培养基营养盐浓度和富集培养与直接培养等对海水蛭弧菌分离、计数的影响,从而建立了海水蛭弧菌分离和纯化的方法--下层1.0%琼脂,上层0.5%琼脂的无营养盐海水双层琼脂平板法。应用无营养盐的海水双层琼脂平板法,采用6种宿主菌分别对海南4份海水样品进行计数检测,发现不同宿主菌所得到的蛭弧菌数量不同,根据噬菌斑的大小、形状和斑形成速度分离出235株蛭弧菌海水菌株,同时对分离纯化到的3株蛭弧菌海水菌株进行液体培养增殖,进一步检验了海水双层琼脂平板法的可靠性。
对利用双层琼脂平板法分离纯化获得的蛭弧菌海水菌株.Bdh5221 裂解特性及生长影响因子进行了初步研究,研究结果表明,蛭弧菌海水菌株:Bdh5221对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、迟钝爱德华氏菌等革兰氏阴性菌有较好的裂解作用,对八叠球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌等革兰氏阳性菌的裂解能力较弱,对木糖葡萄球菌和啤酒酵母菌不裂解;可在超声波破碎后的G<+>菌和酵母菌上生长。蛭弧菌Bdh5221在宿主菌浓度10<6>~10<9>cfu/ml下均可正常生长,高浓度宿主菌更利于蛭弧菌生长;Bdh5221最适生长的pH在7.0~7.5之间,盐度为20~30左右;Bdh5221增殖速度与起始接种浓度影响不大,起始接种浓度10<1>~10<3>pfu/ml下经过5~7d生长可增殖4log左右;Bdh5221保藏选择20%~30%甘油含量较为合适,低温条件更利于保藏。
安全性试验结果表明,添加1.5×10<6>pfu/ml蛭弧菌海水菌株Bdh5221对南美白对虾无毒害作用;添加2.0×10<2>pfu/ml,2.0×10<3>pfu/ml,2.0×10<4> pfu/mlBdh5221均对锯缘青蟹蚤状幼体阶段五个变态期幼体存活率和变态率无影响。锯缘青蟹苗种培育中应用蛭弧菌海水菌株Bdh5221试验,进一步表明,其最适有效添加量为1.5×10<1>pfu/ml;添加蛭弧菌的试验组水体微生态环境明显改善,在育苗后期,相较对照组而言,试验组水体中弧菌和细菌总数都维持在较低水平,两者相差1~2个数量级,而成活率和变态率试验组则比对照组分别高6.6%和6.3%;同时试验组水质有所改善,其中NH<,4>-N比对照组低0.11~0.34 mg/1。
从蛭弧菌在锯缘青蟹苗种培育的应用试验中可以看出,其在海水苗种培育中维持微生态平衡,防治病害方面有广泛的应用前景。