论文部分内容阅读
玉米大斑病菌(无性态Exserohilum turcicum，有性态Setosphaeria turcica)引起的玉米大斑病是玉米生产上一种重要的真菌病害，在世界主要玉米产区都曾造成过严重的经济损失。目前，致病相关基因功能研究的最直接的方法是通过创建该基因的缺失突变体，进一步观察突变体表型上的变化，进而推测该基因的功能。农杆菌介导(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)的遗传转化技术，以其特有的优点成为研究真菌与其寄主互作的有力工具。本研究利用ATMT技术，创建了玉米大斑病菌突变体，并对部分突变体进行了分析，具体结果如下：(1)本文对玉米大斑病菌遗传转化的关键条件、因素和参数进行了摸索和优化，确定了最适筛选转化子的潮霉素浓度为50gg／mL，头孢噻肟钠与羧卞青霉素对农杆菌有效抑制的浓度为200／200μg／mL。确定了共培养最佳方式是将萌发的玉米大斑病菌分生孢子与农杆菌混合物25℃共培养于Fries培养基中，共培养的最佳时间为2d，从接种病斑上分离并萌发的分生孢子作为转化受体其转化效率最高。应用最适的转化条件，试验最终平均从10~5个分生孢子中可获得40～60个玉米大斑病菌转化子。(2)试验对所获得的部分转化子进行PCR及Southern blot验证。根据T-DNA上已知潮霉素基因序列设计引物进行PCR，检测结果发现所检测的转化子均含有目的潮霉素基因片段。随机选取其中4个转化子进行Southern blot验证，结果发现其中2个转化子有杂交信号且为单拷贝插入。(3)将所获得的转化子接种于PDA培养基上，25℃培养7～10d，观察其菌落形态和显微特征，获得了2株菌落形态发生变异的突变体(L-32、L-55)、1株生长速度减慢的突变体(L-14)、3株致病能力丧失的突变体(L-3、L-9、L-43)，未发现孢子形态发生变化的突变体。其中，突变体L-55的产孢能力也完全丧失。