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在测定低浓度的苯暴露时，苯巯基尿酸(S-phenylmercapturic acid，S-PMA)和反．反式粘糠酸(1rans,trans-muconic acid，t,t-MA)都是比较敏感的指标。尿中t,t-MA作为苯及同系物的代谢产物，是一种公认的职业暴露危险度评价的生物标记物，反相液相色谱．紫外检测法采用固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)技术纯化样品是同反．反式粘糠酸的测定相适应的，而液相色谱．二级串联质谱(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)在选择性和灵敏度方面更胜一筹，但相对较低的成本和简便的操作是常规实验室分析的重要因素，通常紫外检测器相对质谱检测器更受青睐，并可以通过改进色谱技术和色谱条件来弥补实验选择性和灵敏度方面的不足。尿中S-PMA也被认为是一种能够评价苯及同系物暴露水平的特异而敏感的生物标记物，在低暴露水平下仍然适用。绝大部分尿中S-PMA的测定方法都是基于色谱分离技术的，高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromal．tography，HPLC)可分离极性的、离子化的、不易挥发的一些有机溶剂，可以连接紫外、荧光或串联质谱检测器。液相色谱质谱联用法(Liquid Chromatography-mass spectrum，LC-MS)弥补了传统LC法的不足，具有高分离能力、高灵敏度和应用范围更广等特点，越来越受到人们的重视。
建立反相液相色谱(=Reverse PhaseHigh Performance Liquid Chromatography，RPHPLC)．紫外检测器测定t,t-MA的方法时，我们一方面选择了成本较低和操作简便的紫外检测器，另一方面采用了高离子强度的流动相和化学稳定性好的反相C8固定相。S-PMA的测定方法，采用高选择性的液相色谱并搭配离子阱质谱检测器，具有良好的敏感性并且避免了复杂的样品处理过程和被分析物的衍生化过程。
实验结果表明采用高效液相色谱联用技术检测尿中的S-PMA和t,t-MA，实验方法的灵敏度和特异性高,而且能避免复杂的样品处理过程，为复杂样品的分析提供了强有力的手段。本研究通过职业卫生检测中心的现有的设备，建立起实用的检测方法，并初步应用于苯及同系物职业暴露人群及苯暴露大鼠尿样的检测，为今后国家制定t,t-MA和S-PMA标准检测方法提供依据。
材料和方法
1．尿中t，t-MA反相液相色谱．紫外检测法的建立根据t,t-MA的理化性质建立反相液相色谱．紫外检测法，通过液-液萃取方式对样品进行前处理。色谱柱的固定相采用Zorbax SB-C<,8>柱代替传统的C<,8>柱，避免了由于污染而造成柱效率逐渐降低的现象发生；流动相为甲醇、乙晴、磷酸混合溶液，采用梯度洗脱的方式实现样品的分离。t,t-MA色谱峰通过紫外检测器定性和定量。
2．尿中S-PMA高效液相色谱．离子阱质谱联用法建立根据S-PMA的理化性质建立高效液相色谱-离子阱质谱联用法，样品通过液-液萃取技术提取后进入色谱柱。色谱柱的固定相采用键合在硅胶上的C<,18>烷基非极性固定相，流动相为乙酸铵和甲醇的混合物，采用梯度洗脱的方式实现样品的分离。以ESI模式进行质谱数据采集，结果可以得到样品的色谱图和质谱图，并对谱图进行分析和归属。
3．苯及同系物职业暴露人群尿中t，t-MA和S-PMA测定的应用选择某船厂油漆岗位的职工为暴露组，并分成低暴露组和高暴露组，无苯及同系物和其他职业病危害因素暴露的管理后勤人员为对照组，根据课题要求设计《职业性苯及同系物暴露个体情况调查表》，逐个对研究对象进行调查。采用气相色谱法(Gas Chromatography，GC)测定空气中苯及同系物的外暴露水平。空气中的苯及同系物用活性碳管采集，二硫化碳解吸后进样，经色谱柱分离，氢火焰离子化检测器检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。
应用建立的反相液相色谱．紫外检测法和高效液相色谱．离子阱质谱联用法分别测定尿中的t,t-MA和S-PMA。
4．苯暴露大鼠尿中t，t-MA和S-PMA测定的应用选取合格要求的36只Wistar大鼠作为研究对象，按体重随机分配成对照组、低浓度组和高浓度组，每组雌雄各半。大鼠在适应环境数天后开始染毒，染毒过程在动态染毒柜内完成，暴露期间不予食物和水，根据染毒浓度和时间的不同确定染毒的换气次数，气流速度等。在每个暴露日对染毒柜内的苯进行采样并测定，稳定其动态浓度。染毒过程中注意观察大鼠的一般活动和有无中毒表现。染毒过程中每隔一段时间称量大鼠体重并做好记录。暴露结束后用代谢笼采集暴露组和对照组大鼠晨尿。将尿液储存在聚乙烯瓶中。酸化保存于低温冰箱中。
应用建立的反相液相色谱-紫外检测法和高效液相色谱．离子阱质谱联用法分别测定尿中的t,t-MA和S-PMA。
5．数据处理与统计分析应用SAS软件包进行统计分析，检验显著水平为0.05。大鼠对照组和低、高浓度组三组间体重比较，动态染毒柜内苯浓度变化情况，人群对照组和低、高浓度组年龄差异用方差分析。低、高浓度组大鼠(人群)尿中的t,t-MA、S-PMA含量差异，人群低浓度组和高浓度组年龄、接苯工龄和苯及同系物暴露浓度差异用t检验。t,t-MA、S-PMA标准曲线的绘制用线性回归分析。
结论：
1．本实验采用反相液相色谱．紫外检测法测定职业人群尿中t,t-MA，样品前处理采用液．液萃取方式，并选用高离子强度的流动相和化学稳定性好的反相C<,8>固定相，改良梯度洗脱策略，从而在缩短样品前处理时间的同时，具有更高的灵敏度。
2．本实验建立的高效液相色谱．离子阱质谱联用法是测定职业人群尿中S-PMA含量的一种有效且高效的分析技术，与传统的GC、HPLC技术相比，其省去了烦琐和耗时的样品处理过程；与LC/MS/MS具有更低廉的检测成本和更早的出峰时间，方法简捷、快速、技术稳定性好。
3．通过对苯及同系物职业暴露人群和苯暴露大鼠尿中t，t-MA和S-PMA的检测分析，发现在有较低苯及同系物职业暴露的情况下，本方法能够较好地检测出两种代谢产物，并有明显剂量效应关系，因此可以认为t,t-MA和S-PMA是反应苯及同系物职业暴露水平比较敏感的生物标志物，本研究建立的方法可以作为苯及同系物职业暴露水平的检测方法。