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机体处于不利环境或遇到有害刺激时会产生应激反应,并伴随着细胞内蛋白质的错误折叠。即使生理状态下,蛋白质在合成过程也难免会发生错误折叠。通常这些错误折叠的蛋白不能形成正确的空间构象而具有细胞、组织毒性。真核生物通过蛋白质量控制系统（protein quality control system,PQCS）调控错误折叠蛋白,维持蛋白质组完整性和细胞功能。PQCS包括辅助蛋白正确折叠的分子伴侣及降解错误折叠蛋白的泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）和自噬。热休克蛋白70羧基端相互作用蛋白（carboxy-terminus of heat shock protein 70-interacting protein,CHIP）具有辅助分子伴侣功能和E3泛素连接酶活性。CHIP通过氨基端与多种热休克蛋白结合,以分子伴侣的作用方式辅助底物蛋白质的正确折叠和帮助错误折叠蛋白的重新折叠;通过羧基端的U-box结构域以E3泛素连接酶作用方式直接催化底物的多聚泛素化修饰进而促进不能修复的蛋白经UPS降解。CHIP参与调控多种致病蛋白的稳定性,尤其是神经退行性疾病相关的致病蛋白,通过促进这些蛋白经UPS降解,减轻细胞毒性而发挥机体保护作用。最新研究发现:CHIP自身的单泛素化修饰是调控其E3泛素连接酶活性的关键性修饰;泛素结合酶E2W（ubiquitin-conjugating enzyme E2 W,UbE2W）通过催化单个泛素分子与CHIP氨基端的2号赖氨酸位点（K2）结合,激活CHIP的E3泛素连接酶功能;CHIP相关的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions,PPIs）可能是调节CHIP活性的关键因素。然而,CHIP与底物之间、CHIP与UbE2W之间的识别和结合等复杂的PPIs的调节机制迄今尚未解析。肽基脯氨酰顺/反异构酶NIMA互作蛋白1（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting 1,Pin1）是肽基脯氨酰顺/反异构酶家族中能够特异性识别并催化底物蛋白中磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸（p Ser/Thr-Pro,p S/T-Pro）基序发生顺/反异构的成员。Pin1有双色氨酸（WW）结构域和肽基脯氨酰顺/反异构酶（PPIase）两个功能结构域,二者均能独立地与特定底物中的p S/T-Pro基序结合,最终由其PPIase结构域催化该基序发生顺/反异构。这种顺/反异构能改变底物蛋白的构象、活性以及与其他蛋白间的PPIs关系,进而对细胞的生理活动以及多种疾病的发生、发展产生影响。CHIP的一级结构中含有4个S/T-Pro基序:S19-Pro、S23-Pro、T246-Pro及S273-Pro,其中S19-Pro、S23-Pro和S273-Pro这3个位点已经被证明可发生磷酸化修饰,具有被Pin1识别和结合的分子结构基础。我们的前期工作发现:Pin1能够与CHIP结合并增强CHIP的功能活性,这些都强烈提示CHIP有可能是Pin1的一个新的催化底物。然而,Pin1是否能催化CHIP特定S/T-Pro基序的顺/反异构进而改变CHIP的蛋白构象,Pin1以何种作用方式调节CHIP的修饰状态及功能活性,迄今尚不明确。多种由突变或错叠蛋白引起的疾病的发生与突变或错叠蛋白对Pin1、UPS中E2和/或E3、分子伴侣等功能活性的损害继而使蛋白质量控制系统（PQCS）功能受损,突变或错叠蛋白不能被及时降解、清除有关。CHIP能促进脊髓小脑共济失调3型（spinocerebellar ataxia type 3,SCA3）致病蛋白——突变ataxin 3经UPS降解,该功能能被Pin1显著上调,但ataxin 3突变体是否损害Pin1、E2、E3功能活性,或是否通过对Pin1、E2、E3功能活性的损害而抑制其经UPS途径降解则有待证明。本研究在利用核磁共振的技术方法对Pin1与CHIP的可能结合位点及可能存在的顺/反异构催化现象进行检测的基础上,分析Pin1、CHIP、CHIP的特异性底物（ataxin 3-80Q）及CHIP的单泛素化修饰酶UbE2W之间的结合关系以及CHIP底物状态（突变）对CHIP活性的影响和机制,从蛋白-蛋白相互作用的角度深入解析了Pin1调节CHIP功能活性的作用模式。1.Pin1通过自身PPIase结构域与CHIP的S273-Pro基序结合为了明确Pin1与CHIP间的相互作用关系和作用位点,对小鼠脑组织及N2a细胞内Pin1与CHIP间内源性作用关系进行了免疫共沉淀（Co-IP）检测。结果显示:无论是小鼠脑组织还是N2a细胞中,内源性Pin1与CHIP都存在相互作用。通过对Pin1的功能结构域行缺失突变,以及对CHIP的上述4个可能与Pin1结合的S/T-Pro基序行点突变后,Co-IP检测发现:Pin1的PPIase结构域是Pin1与CHIP结合的功能区域;CHIP的S273-Pro基序是与Pin1相互作用的位点。2.Pin1与CHIP的结合不影响CHIP的肽基脯氨酰顺/反异构为了确定Pin1是否与CHIP的S273-Pro基序直接结合,通过核磁共振一维扩散系数实验检测了重组表达的Pin1与合成的3条含有1～2个S/T-Pro基序（S19/23-Pro、T246-Pro和S273-Pro）长20个氨基酸残基的CHIP短肽的结合情况。结果发现:Pin1只与含S273-Pro基序的短肽直接结合。为明确Pin1与S273-Pro基序的结合是否催化该位点的肽基脯氨酰顺/反异构,分别合成了含S273位点磷酸化修饰的20个氨基酸残基的短肽和含S273位点磷酸化修饰的CHIP-U-box功能结构域（含63个氨基酸残基的长肽）,采用二维核磁共振交换谱~1H-~1H（2D）ROESY实验检测Pin1对p S273-Pro基序的顺/反异构催化情况。结果显示:CHIP短肽和CHIP-U-box功能结构域长肽中的p S273-Pro基序本身均存在着高效率的自身顺反异构,Pin1的加入没有对CHIP-p S273-Pro基序的肽基脯氨酰顺/反异构产生影响。3.Pin1促进CHIP自身及CHIP与特异性底物之间的相互作用Co-IP分析发现:过表达Pin1能够显著增强CHIP-CHIP的自身结合,沉默Pin1则抑制其自身结合。在过表达CHIP特异性底物SCA3蛋白突变体（ataxin3-80Q）的N2a细胞和HEK293细胞中,免疫荧光染色显示:内源性的Pin1、CHIP和突变蛋白ataxin 3-80Q三者间存在着良好的共定位关系;Co-IP检测表明:ataxin 3-80Q与CHIP和Pin1均能结合;上调Pin1能够增强CHIP与ataxin3-80Q的结合,沉默Pin1则减弱二者间的结合。因此,Pin1可促进CHIP自身及CHIP与特异性底物之间的相互作用。4.Pin1通过增加CHIP的单泛素化修饰增强CHIP底物降解活性我们的前期工作发现Pin1能增强CHIP的活性,促进CHIP对ataxin 3-80Q的降解。已知CHIP氨基端K2、K4和K7 3个赖氨酸位点上的单泛素化修饰是激活CHIP的E3泛素连接酶活性的关键修饰。因此,Pin1与CHIP的结合可能还与CHIP的单泛素化修饰过程相关。免疫印迹结果显示:过表达Pin1显著增强CHIP的单泛素化修饰,而沉默Pin1则相反;对CHIP的上述3个单泛素化位点进行K2R、K4R或K7R单点突变及K2R、K4R和K7R 3个位点同时突变后发现:K4R或K7R单点突变未对Pin1增强的CHIP单泛素化修饰现象产生显著影响,而K2R单点突变则显著抑制Pin1对CHIP单泛素化修饰。由此可见,K2是CHIP分子上Pin1增强CHIP单泛素化修饰的泛素连接位点。进一步对CHIP降解ataxin 3-80Q的能力及对ataxin 3-80Q细胞活力影响的检测发现:在稳定表达GFP-ataxin 3-80Q的细胞中,过表达野生型CHIP能够显著减少聚集型和游离型突变ataxin 3-80Q,并增加细胞活力;K2R、K4R或K7R位点的单点突变,均能抑制CHIP减少ataxin 3-80Q的能力,并削弱CHIP的细胞保护作用,而K2R、K4R和K7R 3个位点同时突变则对CHIP清除底物的功能活性的抑制和细胞活力的降低最为显著。5.Pin1通过促进UbE2W与CHIP的互作增强UbE2W对CHIP的单泛素化修饰UbE2W是目前已知唯一能对CHIP的K2位点进行高效单泛素化修饰的E2,无E2活性但能增强CHIP上K2位点单泛素化修饰的Pin1可能是通过UbE2W实现对CHIP单泛素化修饰。免疫印迹和细胞活力分析结果显示:在过表达Pin1的同时沉默内源性的UbE2W,Pin1所增强的CHIP单泛素化修饰水平显著降低,Pin1所增强的CHIP减少特异性底物ataxin 3-80Q的活性被显著抑制,且Pin1对ataxin 3-80Q稳转细胞的保护作用也被显著抑制。进一步通过Co-IP检测后发现,过表达Pin1时,CHIP与UbE2W结合显著增强;相反,沉默Pin1则显著削弱CHIP与UbE2W的结合。因此,Pin1可通过促进UbE2W与CHIP的互作而增强UbE2W对CHIP的单泛素化修饰。6.Pin1通过与UbE2W互作上调CHIP的单泛素化修饰蛋白与蛋白的相互作用建立在特定结构区域相互结合的基础之上,Pin1促进UbE2W与CHIP的结合,进而增强UbE2W对CHIP单泛素化修饰提示,Pin1与UbE2W之间也有可能存在相互作用。免疫荧光染色显示:在N2a细胞和HEK293细胞中,Pin1与UbE2W、CHIP和CHIP底物ataxin 3-80Q以复合体形式共定位。Co-IP结果显示:N2a细胞内,内源性Pin1与UbE2W存在着相互作用。对Pin1的功能结构域行缺失突变后进行Co-IP检测发现:Pin1的PPIase结构域能够与UbE2W结合。人UbE2W蛋白序列中存在着两个可能与Pin1结合的S-Pro基序S68-Pro和S100-Pro,分别对这两个S-Pro基序行点突变后（S68A、S100A）发现:S68A突变后UbE2W不能与Pin1结合,而S100A突变则不影响上述结合关系;过表达S68A、S100A突变体均能抑制过表达Pin1所增强的CHIP单泛素化修饰,并以S68A突变体的抑制效果最强。由此表明,Pin1通过与UbE2W的结合调节CHIP的单泛素化修饰。7.突变ataxin 3通过抑制Pin1与UbE2W互作下调CHIP的单泛素化修饰蛋白复合体的活性往往会受到底物蛋白性质变化所影响。为了明确突变蛋白底物ataxin 3-80Q是否对CHIP功能复合体的组装以及CHIP的修饰产生影响,在突变蛋白存在的情况下分别对CHIP的单泛素化修饰、CHIP和Pin1与其他因子的结合关系进行检测,结果显示:转染ataxin 3-80Q的细胞中,单泛素化修饰的CHIP水平显著低于转染ataxin 3-20Q的细胞,或无单泛素化修饰。以抗CHIP抗体进行Co-IP实验发现:转染ataxin 3-80Q的细胞中,CHIP与UbE2W的结合明显弱于转染ataxin 3-20Q的细胞。以抗Pin1抗体进行Co-IP则发现,Pin1与UbE2W的结合也显著减少。由此说明,突变蛋白底物的确能通过抑制Pin1与UbE2W的结合而降低CHIP的单泛素化修饰。结论:本研究表明,Pin1以非肽基脯氨酰顺/反异构方式调节CHIP功能,即通过介导UbE2W与CHIP结合促进UbE2W对CHIP的K2位点行单泛素化修饰和介导CHIP功能复合体的形成（包括CHIP-CHIP、CHIP-特异性底物ataxin 3-80Q、CHIP-CHIP修饰/调节性因子UbE2W）而调控CHIP对特定底物的降解能力和细胞保护作用;突变ataxin 3通过抑制Pin1与UbE2W的结合,削弱UbE2W对CHIP的单泛素化修饰能力,这可能是ataxin 3-80Q无法被有效降解和清除的原因。