产单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）能引起人类和多种动物的感染。孕妇、新生儿、免疫功能低下者都是 LM易感人群。LM的主要临床症状是流产、败血症和脑膜炎。在同类食源性病原体中，LM是到目前为止毒力最强的食源性致病菌之一，致死率达20％-30%。　　LM的致病机制复杂，包括多种毒力因子。其中由iap（invasion associated protein)基因编码的 p60蛋白与侵染性相关，是 LM的特异性毒力因子，因其分子量为60 KDa，所以简称为p60蛋白。该蛋白的发现为LM的特异性诊断与检测提供了可能。　　本实验室前期成功构建了可以分泌p60蛋白的基因工程菌。在此基础上，本研究首先采用镍离子亲和层析方法制备得到了重组的p60蛋白，并制备得到了其多克隆抗体，然后建立了基于 p60蛋白的 LM的间接竞争酶联免疫吸附方法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）。主要内容和结果如下。1重组p60蛋白的镍离子亲和层析纯化　　本研究首先采用菌落PCR、NdeI与XhoI双酶切和SDS-PAGE电泳对实验室前期构建的基因工程菌Escherichia coli BL21(DE3)进行了验证。结果表明，p60蛋白基因成功导入BL21菌株中，并且可以产生融合p60蛋白。　　在此基础上，对Ni-NTA纯化重组p60蛋白的条件进行了优化，结果表明，以40 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱杂蛋白，再用250 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白为最佳梯度洗脱条件。在此最佳条件下制备了浓度为1.53 mg/mL的 p60蛋白溶液20 mL，该方法蛋白的提取率为62.8%，纯度达到94.3%，为抗体的制备准备了材料。2抗p60蛋白多克隆抗体的制备　　以上述纯化得到的重组p60蛋白为免疫原，以BALB/c小鼠为实验动物，分别以25、50和100μg/次/只3种免疫剂量，按14 d的免疫间隔期免疫小鼠，3次免疫后，3种免疫剂量均能有效刺激小鼠机体产生抗体，50μg/次/只的免疫剂量抗血清的效价最高，灵敏度最好，分别最高达到1:64000和9 ng/mL。　　为了制备大量的多克隆抗体，在50μg/次/只免疫剂量，第4次免疫后，通过腹腔注射每只小鼠106个骨髓瘤细胞刺激4只小鼠产生腹水抗体。收集腹水，共得到10 mL腹水抗体，以间接ELISA测得其效价为1:8000-1:64000。　　3基于p60蛋白的LM间接竞争ELISA的研究　　以上述获得的p60蛋白及其小鼠腹水抗体为材料，对间接竞争 ELISA的条件进行了优化研究。研究表明：最佳包被液为0.1 mol/L、pH7.4的磷酸缓冲溶液（phosphate buffered saline, PBS），最佳包被时间为37℃下包被1 h，最佳封闭剂为5%脱脂奶粉，最佳封闭时间是37℃封闭1 h，最佳的酶标二抗使用浓度为2000倍稀释。在此基础上，以竞争抑制率为纵坐标（Y,%），LM菌体浓度对数(lgC, CFU/mL)为横坐标（X），得到线性回归方程为：y=-12.5x+75.1，相关系数为0.9952，对LM的最低检测浓度为105 CFU/mL。　　通过与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus）、志贺氏菌(Shigella spp.）、酵母菌(Yeasts）、沙门氏菌（Salmonella）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等微生物进行竞争实验，结果表明，本实验建立的ELISA对LM具有很好的特异性，适合于LM的快速检测。