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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是猪上呼吸道常在条件致病菌,在宿主免疫力低下时引发格拉瑟氏病,主要剖检病变是：多发性浆液性纤维素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎。近年来该病的发生导致全球范围养猪业的巨大经济损失。为了有针对性地制定出高效的综合防治策略必须对该菌的分子致病机理进行剖析阐释。本研究以HPS细胞膨胀致死毒素(Cytolethal distending toxin, CDT)和假定的丝氨酸蛋白酶EspPs(包括EspP1和EspP2)为研究对象。它们都是HPS中已有报道的潜在的致病因子。以往对细胞膨胀致死毒素的研究多采用体外分析的方法,而体内研究的报道较少,而且在HPS中也没有CDT导致细胞凋亡的报道。IgA蛋白酶在逃避宿主天然免疫中发挥着重要作用,曾在流感嗜血杆菌等细菌中有报道,最近发现某些HPS菌株的分泌蛋白有IgA蛋白酶活性,但是还没有在HPS中发现和流感嗜血杆菌的IgA蛋白酶同源的基因,蛋白结构分析和基因序列分析发现HPS菌株SH0165中的假定的丝氨酸蛋白酶EspPs有可能是IgA蛋白酶。本研究主要取得的研究结果如卜：1.构建cdt基因缺失突变株并研究CDT对细胞和豚鼠的致病作用1.1自然转化法筛选得到cdt基因缺失突变株本研究用自然转化法在HPS血清4型野生菌株JS0135中筛选到3个cdt基因缺失突变株,包括JS0135Acdt1、JS0135Acdt2和JS0135ΔCdt1Δcdt2。突变株的构建过程首先要构建质粒pK18-C1G和pK18-C2K,然后通过自然转化分别把这两个质粒转化到实验室保存的标准菌株和野生菌株中,筛选出能共同转化这两个质粒的菌株JS0135(经测序,这个菌株基因组上的cdt也是双拷贝而且和SH0165基因组上的cdt序列相同),经过抗性平皿的筛选,PCR、Western blot、Southern blot等方法的鉴定,这两个质粒上的庆大霉素抗性盒和卡那霉素抗性盒分别等位替换了JS0135基因组上的cdt1和cdt2。cdt的3个缺失突变株构建成功。1.2HPS的CDT引起PK15细胞的形态学变化但不引起PK15细胞凋亡我们用了三种不同的方法,分别是流式细胞术,DNA ladder和细胞核荧光染色技术来检测野生菌株的分泌蛋白和cdt基因缺失株的分泌蛋白对细胞凋亡的影响。希望通过野生株和缺失株对细胞作用的对比来分析HPS的CDT对细胞凋亡的影响。三种不同的方法中,流式细胞术的结果说明CDT能引起细胞在培养48-72h时死亡,这个过程较为迅速,凋亡细胞比例较小；DNA ladder没有出现明显的基因碎裂带,这一结果说明CDT没有引起明显的PK15凋亡；细胞核荧光染色只能看到细胞核膨胀但是没有典型的凋亡细胞核特征——核碎裂现象。以上3种方法共同说明CDT引起PK15细胞膨胀死亡,但是不引起PK15细胞凋亡。另外,我们将野生菌株和cdt基因缺失株的分泌蛋白和菌体蛋白分别作用于PK15细胞,发现野生菌株的分泌蛋白和菌体蛋白引起细胞核明显增大,比对照组大3～4倍,细胞大小不均一,数量减少,细胞核周围存在大量空泡,部分细胞核致密浓染,而基因缺失株则不能,说明HPS的CDT能引起PK15细胞的形态学变化。1.3HPS的CDT对豚鼠的致病作用以MLD剂量对2组豚鼠分别腹腔注射野生菌株JS0135及其cdt缺失突变菌株JS0135Δcdt1Acdt2,注射后连续观察7天发现,(1)与野生菌株相比,cdt基因缺失株致豚鼠死亡率较低,表明CDT与HPS的毒力相关；(2)野生菌株能引起豚鼠内脏器官的病变,主要有肺部充血,大脑充血,胸水腹水增多；(3)在野生菌株感染致死的豚鼠胸水中分离到HPS而cdt基因缺失株感染的豚鼠各脏器未分离到HPS,说明CDT与细菌的侵袭力相关或与抵抗宿主免疫的能力相关。2.假定的丝氨酸蛋白酶EspP1、EspP2具有IgA蛋白酶活性用血清5型野生菌株CF7066及其3个espP缺失株(CF7066ΔespP1、 CF7066ΔespP2pd和CF7066ΔespPl AespP2pd)与猪IgA互作,发现CF7066、 CF7066ΔespP1和CF7066AespP2pd可以特异性切割IgA重链；为了进一步证明这两个蛋白的IgA蛋白酶活性我们分别克隆这两个基因并在大肠杆菌表达菌株E. coli BL21(DE3)中原核表达并纯化它们,然后用纯化的蛋白与猪IgA互作,得到相同的结果。以上结果表明EspP1、EspP2具有IgA蛋白酶活性。