第一部分Mfn2在卵巢功能不全中的表达研究目的研究人线粒体融合基因2(Mitofusin2,Mfn2)在卵巢功能不全中的表达水平,对Mfn2与卵巢功能不全发病关联性作一初步探索。方法采集接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者的卵泡液,分两组:卵巢功能正常组(即Normal group)与卵巢功能不全组(即POI group)。依据连续密度梯度分层的基本原理,使用percoll分离提纯颗粒细胞;免疫印迹方法(Western Blot)用以检测两组颗粒细胞中Mfn2蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)用以检测两组颗粒细胞中Mfn2 m RNA的表达;FITC荧光标记的Annexin V以及PI染料染色后两组颗粒细胞的凋亡评估采用荧光显微镜进行。结果与Normal组相比,POI组Mfn2蛋白和Mfn2 m RNA表达水平均下降,颗粒细胞凋亡增多。结论卵巢功能不全与颗粒细胞内Mfn2的表达水平具有一定相关性;Mfn2低表达可能通过影响颗粒细胞的凋亡参与卵巢功能不全的发生。第二部分Mfn2基因干扰序列及最佳转染浓度的筛选目的使用Mfn2小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)对人颗粒细胞进行转染后优选最佳浓度和高效沉默序列。方法以人Mfn2 m RNA序列作为模板设计并化学合成1对Cy3-si RNA作为对照序列,3对Mfn2-si RNA作为沉默序列。以人卵泡液颗粒细胞作为靶细胞采用不同浓度Cy3-si RNA进行转染,实验分5组:0 n M组、20 n M组、30 n M组、50 n M组和100 n M组,荧光显微镜观察不同浓度转染后颗粒细胞荧光强度差异,优选转染的最佳浓度;利用脂质体2000(Lipofectamine 2000,lip2000)的媒介作用,选择优选浓度转染颗粒细胞,实验分6组:Blank group(未加lip2000)、Regent group(单加lip2000)、Cy3-si RNA group(转染lip2000+Cy3-si RNA序列)、Mfn2-si RNA1 group(转染lip2000+Mfn2-si RNA序列1)、Mfn2-si RNA2 group(转染lip2000+Mfn2-si RNA序列2)、Mfn2-si RNA3 group(转染lip2000+Mfn2-si RNA序列3),运用Western Blot技术和q RT-PCR技术检测各组Mfn2蛋白和m RNA的表达水平,筛选出沉默效果最好的转染序列。结果以不同浓度的Cy3-si RNA转染颗粒细胞后,荧光显微镜观察发现50 n M和100 n M转染浓度时荧光强度最强。q RT-PCR和Western Blot结果显示不同Mfn2-si RNA序列转染后Mfn2 m RNA和蛋白表达水平均下降,其中Mfn2-si RNA序列3下降最为显著。结论基于经济有效原则,在达到实验要求转染效率的基础上,选择50n M作为转染人卵泡液颗粒细胞的优选浓度。Mfn2-si RNA序列3转染细胞后Mfn2表达水平最低,说明沉默效果最佳,因此确定其为最佳转染序列。第三部分Mfn2与卵巢功能不全发病相关性探讨目的观察颗粒细胞中Mfn2沉默后表达水平差异对线粒体代谢、凋亡相关基因表达及颗粒细胞凋亡的影响,揭示Mfn2在卵巢功能不全中的可能作用机制。方法收集卵巢功能正常患者卵泡液,采用密度梯度离心法分离纯化的颗粒细胞作为靶细胞,以lip2000为介质,分别使用Mfn2基因沉默最优序列(Mfn2-si RNA3)和对照序列(Cy3-si RNA)进行转染,实验分两组:对照组(Cy3-si RNA group)和沉默组(Mfn2-si RNA group)。运用q RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测Mfn2 m RNA和蛋白的表达水平,明确沉默有效;分别采用荧光显微镜观察和流式细胞技术检测两组颗粒细胞中线粒体膜电位和颗粒细胞凋亡情况;凋亡相关蛋白Cyt C、Caspases9、Caspases3、Bax、Bcl2的表达运用Western Blot技术进行检测,以明确颗粒细胞凋亡的分子机制。结果与对照组相比,沉默组Mfn2 m RNA和蛋白表达水平降低;线粒体膜电位下降,颗粒细胞凋亡增加;凋亡相关蛋白Cyt C、Caspases9、Caspases3、Bax表达水平均增加,Bcl2表达水平降低。结论沉默组Mfn2表达水平下降同时伴随线粒体膜电位下降、颗粒细胞凋亡增加以及凋亡蛋白表达水平的改变,推测Mfn2低表达可通过线粒体途径影响颗粒细胞能量代谢和细胞凋亡,从而参与卵巢功能不全发生。