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恶性肿瘤是威胁人类健康的三大疾病之一,食管癌（Esophageal Cancer）在世界范围内的发病率位于所有恶性肿瘤的第8位,死亡率位于第6位。我国食管癌的发病人数占世界范围的50%以上,据统计,2015年我国食管癌发病24.6万,发病率为17.87/10万;死亡18.8万例,死亡率为13.68/10万。从病理类型上看,食管癌的主要分为鳞癌和腺癌,欧美主要以腺癌为主,在我国90%以上均为鳞癌,其发病具有明显的家族聚集性和地域性。食管鳞癌的发生主要由环境、饮食习惯、地域等多种因素综合作用所致。食管鳞癌同其他恶性肿瘤一样,由促癌基因和抑癌基因表达失调共同所致。但是,由于目前对于此类食道癌发病相关分子表达变化及其分子机制仍不明确,研究食管癌的发病机制具有极其重要的意义,能够为食管癌的治疗提供新的靶点,对于提高食管癌患者的治疗效果及改善预后具有重要的意义。MicroRNA（MiRNA）是一类内源性非编码的小RNA,通常由2l-25个核苷酸组成的,在人体内起着调节细胞基本生理功能的作用。研究显示miRNA可通过调节下游靶基因影响肿瘤的发生和发展,有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。这些miRNA既有抑癌作用、也发挥促癌效应。既往研究证实多种miRNA在食管鳞癌组织及细胞中表达失调,其表达变化与食管鳞癌的恶性度及预后相关。MiR-301a-3p是miR-301家族的一员,广泛表达于人体各个器官,具有重要的生物学功能,同多种肿瘤发生相关。但是,miR-301a-3p在食管鳞癌发生中的作用尚不明了。为了研究其在食管鳞癌中的作用,本文首先比较了食管癌组织与癌旁组织、食管鳞癌细胞与正常粘膜细胞中miR-301a-3p表达水平,并分析其表达水平与患者临床特征、术后病理分期之间的相关性;接着验证了miR-301a-3p对食管癌细胞增殖活性的影响;然后分析寻找并验证miR-301a-3p的下游靶基因,最后探讨miR-301a-3p调节食管癌细胞增殖活性的分子机制。第一部分miR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及临床意义目的:明确miR-301a-3p在食管鳞癌组织、细胞中及正常食管粘膜组织、细胞中分别表达情况,及其表达水平与食管鳞癌患者临床病理特征之间的关系。方法:收集行手术切除的食管鳞癌患者的肿瘤及配对正常组织标本,并培养食管鳞癌细胞系及正常食管粘膜上皮细胞系,用Real-time PCR方法检测miR-301a-3p在食管鳞癌组织、正常组织及不同细胞系中的表达差异。收集患者临床资料,分析miR-301a-3p表达水平与患者临床特征及病理学之间的关系。结果:miR-301a-3p在食管鳞癌组织中的表达水平显著高于正常组织（P<0.01）;与正常食管粘膜细胞HET-1A相比,miR-301a-3p在食管鳞癌细胞系Eca109、TE-1中的表达均显著升高（P<0.001）。MiR-301a-3p高表达与术后病理中的淋巴结转移（P=0.017）、肿瘤长度超过4cm（P=0.03）以及TNM分期（P=0.009）呈显著相关。小结:miR-301a-3p在食管鳞癌组织及细胞系中的表达水平比正常食管粘膜组织和正常食管细胞系中升高,miR-301a-3p的相对表达量高低与食管鳞癌的肿瘤长度、淋巴结转移情况以及TNM分期相关。第二部分miR-301a-3p通过调控PI3K/AKT通路影响食管鳞癌细胞增殖目的:miR-301a-3p在多数肿瘤中发挥促癌基因的效果,在不同的肿瘤中发挥作用的机制不同。本部分研究miR-301a-3p通过调控PI3K/AKT通路对食管鳞癌细胞增殖及克隆的影响。方法:通过在食管鳞癌细胞系中转染miR-301a-3p mimics/inhibitor使其过表达或抑制其表达,用Real time PCR法验证过表达及抑制效果。通过MTT实验和克隆平板实验检测miR-301a-3p对食管鳞癌细胞增殖及克隆形成能力的影响。使用免疫印迹试验检测转染后PI3K/AKT通路中p-AKT/AKT比值,以及下游蛋白BCL-2,BAX的表达变化。在回复实验中使用PI3K特异性抑制剂LY294002处理被miR-301a-3p转染的Eca109细胞系后,再检测p-AKT/AKT比值,以及BCL-2,BAX的表达变化。通过以上实验明确miR-301a-3p对食管鳞癌细胞系Eca109的作用,并验证其调控PI3K/AKT信号通路。结果:1.转染miR-301a-3p mimics/inhibitor后miR-301a-3p的表达变化。在实验中使用Eca109细胞建立体外细胞模型,使用Real-time PCR检测不同分组中miR-301a-3p的表达情况,结果显示:在实验组中转染miR-301a-3p mimics后,miR-301a-3p表达量显著增高,与阴性对照组的相对表达量分别为:3.96±0.39,1±0.08,具有统计学差异（P<0.01）。转染miR-301a-3p inhibitor的实验组与阴性对照组的相对表达量分别为:0.34±0.08,1±0.13,具有统计学差异（P<0.01）。证实转染成功,可以进行后续的实验。2.miR-301a-3p表达对食管鳞癌细胞Eca109增殖能力和克隆形成能力的影响。MTT实验显示,细胞转染48小时后,转染miR-301a-3p mimics的实验组Eca109细胞系和转染Negative Control（NC）mimics的对照组的OD值分别为0.765±0.050vs0.560±0.049（P<0.05）;在转染miR-301a-3p inhibitor后的48小时,实验组和对照组的OD值分别为0.483±0.054 vs0.616±0.040（P<0.05）,证实与对照组相比,Eca109细胞转染miR-301a-3p mimics后增殖能力显著增强,转染miR-301a-3p inhibitor后增殖能力显著下降,证明miR-301a-3p具有促进细胞增殖的作用。在细胞克隆实验中,转染miR-301a-3p mimics的实验组和转染NC mimics的阴性对照组的克隆形成数分别为:201±15 vs 138±12（P<0.05）;在转染miR-301a-3p inhibitor的实验组和对NC inhibitor的对照组中分别为:58±6vs116±12（P<0.05）。证明转染miR-301a-3p mimics后Eca109细胞克隆形成能力显著增强,转染miR-301a-3p inhibitor后Eca109细胞克隆形成能力显著下降。3.miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值、BAX和BCL-2表达的影响。转染miR-301a-3p mimic实验组Eca109细胞系的实验组中p-AKT/AKT和BCL-2表达高于对照组,BAX表达低于对照组（P<0.05）。转染miR-301a-3p inhibitor的实验组中p-AKT/AKT和BCL-2表达低于对照组,BAX表达高于对照组（P<0.05）。4.回复实验:使用LY294002处理miR-301a-3p mimics转染的Eca109细胞后,BCL-2蛋白表达升高,BAX蛋白表达降低,与对照组的Eca109细胞系中BCL-2蛋白,BAX蛋白表达差异具有统计学意义。证明miR-301a-3p通过PI3K/AKT通路调节BCL-2、BAX表达。小结:miR-301a-3p可增强食管鳞癌细胞增殖和克隆形成的能力,通过激活PI3K/AKT通路及下游BCL-2、BAX蛋白在食管鳞癌细胞中促进肿瘤增殖和克隆形成。第三部分miR-301a-3p在食管鳞癌细胞中的作用靶基因的筛选及验证目的:通过第二部分的实验观察到,miR-301a-3p可通过激活PI3K/AKT通路提高食管鳞癌细胞的增殖和克隆能力,但其具体作用的靶基因尚不明确。本部分研究筛选miR-301a-3p靶基因并进行验证,阐明其作用机制。方法:用miRBase软件（http://www.mirbase.org）预测miR-301a-3p靶基因,找到表达受到miR-301a-3p负性调控且在PI3K/AKT通路发挥作用的蛋白PTEN。在17对食管鳞癌患者的肿瘤组织及正常组织中,用Western Blot方法检测PTEN的表达情况,用RT-PCR的方法检测miR-301a-3p的表达,并检测二者之间的相关性。在Eca109细胞中转染miR-301a-3p mimics/inhibitor后,检测靶基因PTEN在细胞中的表达水平。构建含有靶基因PTEN m RNA的3’UTR区的荧光酶报告质粒,通过双荧光素酶报告基因实验,验证miR-301a-3p与PTEN的m RNA的3’UTR区是否直接结合来调控其表达。接下来在Eca109细胞系中进行回复实验,分为四组,并在各组内共同进行MTT实验及克隆形成试验,检测细胞的增殖能力;进一步应用Western Blot方法检测各组细胞中p-AKT/AKT比值,BCL-2和BAX的表达情况。通过以上回复试验,验证PTEN是否能逆转miR-301a-3p在Eca109细胞系的调控作用。结果:1.通过预测发现,miR-301a-3p和PTEN 3’UTR的398-418 nt存在互补结合位点。荧光素酶活性分析结果显示,Eca109细胞中野生型PTEN的荧光活性被miR-301a-3p显著抑制,但miR-301a-3p并不影响Eca109细胞中突变型PTEN的荧光素酶活性,表明miR-301a-3p可以和PTEN进行特异性结合。2.在组织及细胞中miR-301a-3p与PTEN表达呈负相关。收集了17对ESCC组织和正常组织。Western Blot及Real time-PCR结果显示,与正常组织相比,ESCC组织中PTEN蛋白水平降低（P<0.01）,PTEN在食管鳞癌组织中的表达水平与miR-301a-3p的表达呈负相关（R2=0.5945,P<0.01）。在Eca109细胞系中转染miR-301a-3p mimics后,PTEN的表达显著降低（P<0.05）;反之,转染miR-301a-3p inhibitor后,PTEN的表达升高（P<0.01）。3.PTEN可逆转miR-301a-3p对食管鳞癌细胞Eca109增殖能力和克隆形成能力影响。首先应用miR-301a-3p mimics+PTEN组及其相关对照组进行实验,转染一定时间后,进行MTT细胞增殖实验和克隆形成实验。结果显示:MiR-301a-3p mimics+PTEN组的细胞的增殖和克隆形成能力较miR-301a-3p mimics+NC PTEN组明显降低（P<0.05）。证明PTEN能逆转miR-301a-3p对细胞增殖和克隆形成能力的促进作用。再应用miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组及相关的对照组进行实验,在转染一定时间后,进行MTT细胞增殖实验和克隆形成实验。结果显示:miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组的细胞增殖和克隆能力较miR-301a-3p inhibitor+NC si-PTEN组明显增强（P<0.05）。证明si-PTEN与miR-301a-3p inhibitor转染后,能回复miR-301a-3p inhibitor对细胞增殖能力的抑制作用。4.PTEN可回复miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2表达的影响。分组情况与上一步相同,首先应用miR-301a-3p mimics+PTEN组及其相关的对照组进行实验,在转染48小时后,应用Western Blot方法,检测Eca109细胞中p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2的相对表达情况。miR-301a-3p mimics+PTEN组较miR-301a-3p mimics+NC PTEN组p-AKT/AKT比值及BCL-2的相对表达量均降低,BAX相对表达量升高（P<0.05）。结果证明miR-301a-3p能使得p-AKT/AKT比值和BCL-2的表达量升高,BAX的表达量降低,而共转染PTEN后能逆转miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值、BCL-2和BAX蛋白表达的作用。同样,在转染48小时后,应用Western Blot方法检测miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组及其相关的对照组中Eca109细胞中p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2的表达。MiR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组较miR-301a-3p inhibitor+NC si-PTEN组p-AKT/AKT比值,BCL-2的相对表达均升高,BAX相对表达降低（P<0.05）。结果证实miR-301a-3p inhibitor能使得p-AKT/AKT比值和BCL-2的相对表达降低,BAX相对表达升高,而共转染si-PTEN后能回复miR-301a-3p inhibitor对信号通路及蛋白的作用。小结:miR-301a-3p可通过特异性靶向结合PTEN调节PI3K/AKT通路促进Eca109细胞增殖。结论:miR-301a-3p在食管鳞癌组织及细胞中表达上调,miR-301a-3p的高表达与食管鳞癌的淋巴结转移、肿瘤长度以及TNM分期相关;miR-301a-3p可促进食管鳞癌细胞增殖和克隆形成;通过激活PI3K/AKT通路,调节下游BCL-2、BAX蛋白表达变化,miR-301a-3p可起到增强食管鳞癌细胞增殖和克隆形成,促进肿瘤生长的作用;miR-301a-3p通过与PTEN的m RNA 3’UTR区靶向结合,抑制其表达,从而促进食管鳞癌细胞增殖。