随着我国养羊业集约化的不断扩大,羊群疾病发生的种类在不断增加,近年来,出现的羊的一种新的疾病给规模化养羊场造成了巨大损失,对养羊业造成了严重威胁。该病主要表现为咳嗽、呼吸困难、急性死亡。通过流行病学调查和病原检测,探明了导致该病的主要病原菌为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa, PA ),继发病原菌或混合感染菌为大肠杆菌(Escherichia colibacillosis ,E.coli)。本研究在确定绿脓杆菌为主要病原菌,大肠杆菌为继发病原菌或混合感染菌的基础上,重点对这两种菌的血清型、生物学特性、致病特性、药物敏感性、疫苗的制备及初步应用等方面进行研究,从而为该病的预防控制提供理论依据。本课题分六部分进行研究第一部分:羊绿脓杆菌病流行病学调查 通过对济南历城、长清、槐荫、华山、章丘、济宁、兖州、枣庄等地11个不同发病羊场和东营、莱芜两个未发病羊场的调查,发现任何年龄的绵羊、山羊均可感染本病,以0.5～2.5岁为主。发病以春末夏初和秋末冬初为主,无明显周期性。饲料因素、应激因素、环境因素、管理因素、疫苗注射污染、抗生素的长期使用等等都可能导致此病的暴发。用平板凝集法对11个发病羊场和2个未发病羊场采血检测抗体阳性率。结果11个发病羊场羊的抗体阳性率均为100%。 2个未发病羊场羊的抗体阳性率分别为21%和69%。说明表面健康羊群可能曾感染过此菌或现在体内正带菌,一旦饲养管理条件下降,很可能导致发病。说明了在生产实践中良好的饲养管理条件的重要性。 第二部分:羊病原菌的分离、鉴定及毒力测定 采用微生物学的方法,对11个发病羊场进行了系统的病原学研究。通过分离培养、显微镜检查,发现引起该病的病原体是两种革兰氏阴性杆菌,都无芽胞和荚膜,有鞭毛。一种是两端钝圆较细小杆菌,能产生水溶性的绿色色素。一种是两端钝圆的粗短杆菌。两种菌的菌落特征、培养特性、生化特性都不一样。根据培养特性,再结合生化试验和其它试验以及用ID32E试验条 API鉴定系统<WP=12>测定,最终鉴定这两种菌分别为绿脓杆菌、大肠杆菌。通过动物致病性试验,将绿脓杆菌、大肠杆菌、混合菌的18h肉汤培养物分别腹腔接种小白鼠(0.2ml/只)。接种绿脓杆菌和混合菌的小白鼠均于24h内死亡,并且都分离到绿脓杆菌、大肠杆菌两种菌。接种大肠杆菌的小白鼠无死亡,大肠杆菌4倍浓缩后接种小白鼠(0.2ml/只),则于24h内死亡,并且只分离到大肠杆菌。接种两种菌的死亡速度比接种单菌的死亡速度要快2-4h。绿脓杆菌接种成年家兔(0.3ml/只)、一月龄鸡(0.2ml/只),均于24h内死亡,并且都分离到绿脓杆菌、大肠杆菌两种菌。用绿脓杆菌接种健康羊(2ml/只),复制出了与自然发病羊相同的症状,并从人工发病死亡羊体内也回收到了绿脓杆菌、大肠杆菌两种菌。所以最终可确定该病是由绿脓杆菌引起的,大肠杆菌是继发菌或混合感染菌。随机挑选5株绿脓杆菌按Karber法,进行半数致死量的测定,结果差异不显著。第三部分:绿脓杆菌、大肠杆菌的血清学分型 采用玻片凝集法用17型国际抗原分型系统 (IATS)进行分型,分型率为90.9%。分离的11株绿脓杆菌中有7株是Ⅰ型I群,1株Ⅱ型K群,1株Ⅱ型B群,1株Ⅲ型G群和1株未分型。说明山东省绿脓杆菌的流行菌株血清型为Ⅰ型I群,占63.6%。大肠杆菌送至中国兽药监察所进行分型,分型率为72.7%。分离的11株大肠杆菌中有4株是O93(O8)(37.4%), 2株是O39(18.2%), 1株O56(9.1%),1株O18(9.1%),3株未分型(27.3%)。说明绿脓杆菌继发或混合感染的大肠杆菌的主要血清型为O93(O8)。第四部分:病原菌在不同条件下的致病作用 用绿脓杆菌肉汤原液、离心沉淀菌体的生理盐水还原液及上清液对小白鼠进行腹腔攻毒,发现肉汤原液的致病作用大于菌体的生理盐水还原液,上清液也有一定的致病作用。用绿脓杆菌、大肠杆菌、混合菌的肉汤培养物的10倍稀释液、1000倍稀释液对小白鼠进行饮水攻毒一周,同时限制喂料,结果试验第二天开始小白鼠精神沉郁,食欲不振,不愿活动,背毛松散,失去光泽,而对照组小鼠活泼,毛有光泽,一切正常。试验第八天停止攻毒,仍限制喂料,试验组小鼠陆续开始死亡,试验第15天恢复正常饮水、喂料。绿脓杆菌10倍稀释液的死亡率80%,1000倍的死亡率40%。大肠杆菌10倍稀释液的死亡率90%, 1000倍稀释液死亡率50%。混合饮水10倍稀释液死亡率<WP=13>90%,1000倍稀释液的死亡率60%。且两种菌混合感染致死率大于单菌感染致死率。试验第21天随机各组取1只存活小白鼠解剖,病理变化不明显,细菌分离培养只分到相应的攻毒菌。试验第25天再重复上述试验,解剖小鼠没有病理变化,细菌分离培养分不到任何菌。将剩下的小鼠全部解剖,进行分离培养,均未分到任何菌。说明如果在饲养管理条件较好的情况下,感染病原菌的小鼠可以自行恢复健康,如果饲养管理条件较不好就会发病,进一步证明了在生产实践中良好的饲养管理条件的重要性。第五部分:药敏试验 用11种临床常用抗生素的药敏纸片按常规法和ATB VET 系统测定对分离到的菌株进行药敏实验,发现从不同羊场分离到的绿脓杆菌、大肠杆菌的敏感药物不尽相同,可能与各羊场平时用药不同及菌株的血清型不同有关。绿脓杆菌的高敏药物有丁胺卡那霉素、多粘霉素E、环丙沙星、氧氟沙星等,大肠杆