产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens, C. perfringens)是一种重要的人兽共患病病原体,广泛分布于自然界,导致多种动物发生坏死性肠炎、肠毒血症,以及人类的气性坏疽和食物中毒。产气荚膜梭菌分泌的多种毒素在其引发的疾病中具有重要作用。本实验对所有产气荚膜梭菌均能分泌的α毒素与另一种新型毒素NetB毒素进行原核表达,通过PCR方法分别扩增编码α毒素去除信号肽后的plc基因片段和去除信号肽的NetB基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc和pGEX-NetB,经双酶切鉴定和序列测定后转化至大肠杆菌BL211(DE3)感受态细胞,进行IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,当1.0mmol/L IPTG诱导5h时重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,两个重组蛋白的相对分子质量分别为66kDa和62kDa。表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备单克隆抗体。将纯化蛋白pGEX-plc和pGEX-NetB免疫BALB/c小鼠,加强免疫3d后取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆后获得9株分泌抗plc单克隆抗体的杂交瘤细胞(分别命名为H8C11、F4D9、F4C3、H11H12、F4G12、H8F8、 A10H9、A10E5和G7H8)和5株分泌抗NetB单克隆抗体的杂交瘤细胞(分别命名为D6H8、 F9G3、E7G2、E11C11和E7B11)。经Ig亚类鉴定试剂盒检测,表明A10E5和A10H9属于IgG2a, D6H8属于IgG2b,其余均属于IgG1。Western blot结果表明所有单克隆抗体均与相应的融合蛋白反应并出现特异性条带,其中A10H9和A10E5能够识别产气荚膜梭菌分泌的a毒素。制备的H8C11、F4D9、F4C3、D6H8、F9G3和E7G2腹水经辛酸-饱和硫酸铵法纯化后可见清晰的IgG的重链和轻链,分子量大小分别约为58kDa和26kDa。经间接ELISA方法检测,腹水中单克隆抗体的效价明显高于杂交瘤细胞上清,并且体外传代10次以上的杂交瘤细胞仍具有稳定分泌单克隆抗体的能力。抗α毒素杂交瘤细胞染色体的平均数量为91.1条,抗NetB毒素杂交瘤细胞染色体的平均数量为88.2条,均多于SP2/0细胞的56条染色体。免疫荧光试验证明,7株抗plc单克隆抗体(除G7H8和H11H12以外)能够结合产气荚膜梭菌的菌体表面。中和试验证明本实验制备的所有抗plc单克隆抗体都具有a毒素中和活性。