疟疾是一种由疟原虫感染引起并经按蚊传播的寄生虫病。疟原虫是单细胞真核原生生物,生活史包括两个宿主:哺乳动物与雌性按蚊。疟原虫在两个宿主体内交替寄生完成其生活史。疟原虫在哺乳动物宿主红细胞内进行无性增殖,一部分红细胞期疟原虫通过有性转化形成雌雄配子体,哺乳动物宿主一旦被按蚊吸血,血液中的雌雄配子体从37℃的恒温体温环境进入到按蚊中肠22℃的消化道环境,迅速感受按蚊消化道低温与中肠化合物黄尿酸（XA）的刺激,启动XA-cGMP-PKG-Ca2+信号通路开始配子发生的过程。XA刺激到胞内Ca2+浓度显著提升只需10-15 s。一个雄配子体经过三轮DNA复制和鞭毛丝的组装,最终胞质分裂形成八个带单根鞭毛会游动的雄配子;一个雌配子体被激活形成一个雌配子,雌雄配子体的激活过程即为配子发生过程。雌雄配子体在按蚊中肠被激活形成雌雄配子是疟原虫建立按蚊感染的第一步。迄今为止,疟原虫如何感受或者传递XA信号的关键分子仍然未知。在本工作中,我们选择了 59个配子体时期转录表达的膜蛋白编码基因作为候选,通过CRISPR/Cas9方法进行单基因敲除,获得了 45个单基因敲除的虫株。配子发生的表型筛选发现GEP1（Gametogenesis Essential Protein 1）蛋白对于配子发生是必需的。GEP1敲除后不影响疟原虫在无性阶段的生存,不影响雌雄配子体的产率,但按蚊感染实验结果显示,GEP1缺失的配子体感染按蚊后不能形成中肠卵囊和唾液腺子孢子;体外诱导雄配子体激活实验表明GEP1敲除雄配子体不能被激活形成出丝点,体外诱导动合子不能产生动合子。进一步对配子体激活后发生的细胞事件检测发现,GEP1敲除虫株的配子体cGMP合成能力缺陷,XA刺激后无法上调胞内cGMP浓度,cGMP信号是迄今为止所知的配子发生所需的最上游起始信号,这一缺陷使得下游一系列胞内事件不能发生,包括胞内Ca2+含量的提升,雄配子体鞭毛丝的组装运动,雌配子体翻译抑制解除以及雌雄配子体红细胞膜和PVM的破裂发生。为了分析GEP1在配子发生信号起始中的作用机制,首先通过免疫沉淀结合质谱分析技术对GEP1的互作蛋白进行了检测发现鸟苷酸环化酶α即GCα与GEP1互作。cGMP由鸟苷酸环化酶产生,疟原虫基因组中仅有两个鸟苷酸环化酶的编码蛋白,GCα与GCβ。进一步通过GEP1与GCα双标签虫株的配子体免疫共沉淀实验证实了 GEP1与GCα存在互作,GEP1与GCα在雌雄配子体中都表达且都呈胞质的似囊泡状点状分布定位,免疫荧光及Duolink实验检测GEP1与GCα在配子体胞内呈现共定位。通过启动子替换的方法获得GCα在配子体阶段特异性表达下调的虫株gcα knock down虫株并验证发现,gcα knock down虫株的cGMP合成能力表现缺陷,配子体不能被激活,按蚊感染完全阻断,其表型同GEP1敲除一致。而疟原虫GCβ只在雌配子体中特异表达,在雄配子体中不表达,GCβ的敲除不会造成疟原虫配子体激活的缺陷。综上,GCα被认为是在配子体阶段唯一发挥功能的cGMP合成酶,并且其鸟苷酸环化酶活性受到GEP1的调控。以上的结果表明:GEP1是通过与GCα互作控制了疟原虫配子体激活过程cGMP的合成与配子发生过程,为疟原虫配子体激活的分子机制研究提供了一个新的切入点,配子发生是疟原虫感染按蚊的第一步,也为疟疾阻断提供了新靶标。