论文部分内容阅读
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的烃类,具有毒性、致突变性、致癌性。深海是PAHs污染物的一大归宿地,但目前尚未有相关降解菌报道。为了解深海自然环境中的微生物在PAHs污染中的自净与修复作用,并寻找该深海环境中主要的PAHs降解细菌,本论文对西南印度洋中脊深海水样中降解菌的多样性进行研究。三个采样点共十个不同层次的深海水样,深度从688至3114米,分别以萘、菲、蒽和芘作为混合碳源富集得到十个PAHs降解菌群。采用单菌分离鉴定及构建16SrDNA文库与DGGE相结合的方法对这些菌群的结构进行了解析。十个菌群共分离到94株不同单菌,分属于31个属39个种,主要为变形菌纲a和γ亚群,食烷菌、海杆菌、Kaistia,海旋菌、Maricaulis和Nitratireductor占优势,其中5株菌可能属于新属,10株菌属于新种。通过构建16SrDNA文库与DGGE结合的方法,确定十个降解菌群中主要的主要降解菌为食烷菌、海杆菌、海旋菌、新鞘氨醇杆菌、气单胞菌、赤细菌、解环菌及Parvularcula,并且发现仍有大量的降解菌未分离培养出来。其中解环菌仅在最底层的水样中富集到,气单胞菌仅在菌群3PC123中发现,赤细菌仅在菌群3PC139中发现,Parvularcula仅在菌群3PC99中发现,其它四个属则在多个菌群中占优势。通过比较测定十个降解菌群不同培养时间的菌体浓度及菌群结构变化,发现菌群培养30天达到最稳定状态。菌群培养40天后培养基中的碳源萘和菲仅有微量残留,蒽和芘则还有一半左右的残留量。十个降解菌群中长势最好的菌群2PC121转接到7种PAHs单碳源及高环与低环PAHs组合碳源培养时,发现菌群以不同碳源组合培养时生长特别好,四环的芘和荧蒽与三环的菲组合时降解效果特别好。海旋菌和食烷菌在多个降解菌群中存在,特别是食烷菌更是在多个降解菌群中成为优势菌,因此本文对此两个属的菌进行了系统的比较分析。海旋菌在降解菌群中广泛存在,单菌功能验证暂未发现有降解能力,目前也未有相关文献报道其功能。本研究对分离自不同海域的52株海旋菌,以及3个模式种,采用16SrDNA、看家基因gyrB及重复PCR进行系统分类比较。结果发现它们的16SrDNA序列与相应模式种高达99%以上,少数为98%以上,但不同海域来源的菌株间的gyrB差异确很大,可见海旋菌的多样性。通过gyrB的系统发育树分析,可以将52株海旋菌中分出7类可能的新种,目前正在进一步的鉴定中。重复PCR的结果也支持gyrB的分析结果,另外发现,gyrB序列一样的菌株,其重复PCR的带型也完全一样,gyrB序列不一样的则带型存在差异,且gyrB序列差异越大的其带型差异也越大,这也充分证明重复PCR技术的可靠性与灵敏性。一株在十个PAHs降解菌群中均有发现的食烷菌P40与5株食烷菌模式种通过16SrDNA和看家基因gyrB的系统分类比较,结果发现菌株P40与Alcanivorax dieseloleiB-5~T的16SrDNA相似度高达99%,但gyrB相似度只有87%,蛋白序列为96%,而与同样分离自深海的Alcanivorax dieselolei NO1A的16SrDNA的相似度也是99%,gyrB核酸相似度则高达99%,蛋白序列更是达100%,菌株P40和NO1A可能是柴油食烷菌的一个深海表型。