目的:1.回顾性观察祛瘀解毒方联合现代治疗手段治疗晚期大肠癌肝转移患者的临床疗效并对于潜在优势人群进行探索性分析2.以转录组学为技术支撑,通过分析HCT116人源肠癌细胞给药前后(祛瘀解毒方和木犀草素)差异表达基因的生物信息学并结合前期研究基础,探索祛瘀解毒方治疗大肠癌的潜在机制3.观察药物(祛瘀解毒方和木犀草素)作用下Nrf2信号通路的变化,并从DNA甲基化角度阐述其具体机制方法:第一部分:回顾性分析祛瘀解毒方治疗晚期大肠癌肝转移患者的临床疗效:参照中国结直肠癌诊疗规范(2017年版)与《肿瘤中西医治疗学》[林丽珠主编.人民军医出版社,2013]的诊断标准,筛选自2008年1月～2017年12月,于广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心就诊并符合纳入标准和排除标准筛选后患者共191例,男性70例,女性121例。1.记录患者基线数据,包括:括性别,年龄,TNM分期、肿瘤原发部位等,以及患者从确诊到观察结束是接受的所有治疗手段。以生存时间作为主要的研究结局,定义为确诊大肠癌同时性肝转移到死亡的时间,以天数作为时间单位。所有数据更新至2018年12月30日。当无法检索到具体的死亡日期时,将患者死亡月份的月中设置为死亡日期;随访以我院病历系统为主,出院患者电话随访。2.采用单因素COX回归分析明确本研究中患者生存结局的干预因素,包括性别,肝转移时效性(同时/异时),肿瘤分期(T/N)、肿瘤分期、肿瘤原发灶部位(左/右)、KPS评分、CEA水平(正常/异常)、原发灶手术、肝转移灶局部治疗、靶向治疗、化疗以及中药暴露程度(低/高);对于中药暴露程度这一核心研究点,对其进行了多因素COX回归分析3.对中药暴露程度这一因素进行分层分析,探索性分析中药暴露程度对性别、年龄、肝转移时效、原发肿瘤部位、肿瘤分化程度、肝转移灶数目、KPS评分、治疗方案(原发灶/转移灶手术、肝转移灶局部治疗、化疗、靶向治疗)亚组总生存期的影响。第二部分:基于转录组测序探讨祛瘀解毒方及其有效单体干预大肠癌的潜在机制:将HCT116分为空白对照组(0.1%DMSO),祛瘀解毒方组(8mg/ml)以及木犀草素组(30μM),处理48h后,收集细胞进行转录组测序。1.采用Qiagen公司RNeasy Mini Kit从各组细胞中提取RNA,使用NanoDrop-8000紫外分光光度计测定RNA浓度,电泳检测RNA完整性。采用Agilent 2100 bioanalyzer对文库的插入大小进行检测评价文库通过是否质检。按照Illumina User Guide准备测序试剂,将携有cluster的flow cell上机,选取paired-end程序进行双端测序。2.过滤Raw Reads中末端质量相对偏低、总体质量相对较低或者含引物等不合格的 reads 得到 clean Reads,以 FASTQ 格式存储;利用 Hisat2(Version2.1.0)的 spliced mapping算法将clean Reads与制定的参考基因组进行序列对比,以获取在参考基因组或者基因上的位置信息以及样品Reads特有的序列特征信息;利用FeatureCounts重新计算与基因组特征重叠的Reads,形成全基因组范围的差异转录谱。3.对差异表达最显著的基因进行靶基因注释、功能富集性分析(Gene Ontology,GO)以及信号转导通路(Pathway)分析。第三部分:探讨祛瘀解毒方及木犀草素激活Nrf2通路的表观遗传学机制1.采用MTS法测定不同浓度下祛瘀解毒方及木犀草素对于肠癌HCT116细胞活力的变化,确定祛瘀解毒方及木犀草素后续实验干预浓度;同时通过软琼脂克隆实验探讨不同浓度的祛瘀解毒方及木犀草素对HCT116细胞增殖和侵袭能力的抑制作用。2.采用Luciferase、qPCR以及Western Blotting实验手段检测祛疲解毒方及木犀草素对抗炎抗氧化Nrf2通路mRNA及蛋白表达水平的调控作用3.应用BSP技术检测给药前后(祛瘀解毒方和木犀草素)Nrf2基因BM-1区三处CpG位点的甲基化状态,并通过Western Blotting检测祛癖解毒方及木犀草素对DNA甲基化转移酶蛋白表达的调控作用。结果:第一部分:1)截止至研究时间结束(2018年1月10日),共入组191例患者,其中166例死亡,13例存活,12例患者失联。结果显示高暴露组和低暴露组中位OS分别为26.13 vs 14.67个月;经Log-rank检验,p<0.001,差异具有统计学意义。2)单因素回归分析结果显示:中药高暴露、病理中分化、KPS评分(70/80/90)、原发灶/转移灶手术治疗、局部治疗、靶向/化学治疗的HR值<1,属于保护因素;CEA≥5的HR值>1,属危险因素。鉴于中药高暴露组与低暴露组基线水平不均衡,COX多元回归分析结果显示:排除其他因素对于HR的影响,相对于低暴露组,中药高暴露组可以明显改善患者预后,差异具有统计学意义(p<0.05)。3)探索性亚组分析结果显示:在性别、肝转移时效方面,中药高暴露均可以降低患者死亡风险,差异具有统计学意义;同时,无论配合原发灶手术、靶向治疗和肝转移灶局部治疗,中药高暴露可显著降低患者HR。而在年龄分层中,我们发现65-85岁年龄段患者接受中药治疗的生存获益无统计学意义;左半结肠癌患者较右半结肠癌患者有更显著的生活获益,这与大数据分析结果具有一定的相似性;其中,中高分化肠癌较低分化肠癌患者HR降低更明显,且中分化亚组具有统计学意义,而高分组亚组考虑样本量过小引起的假阴性结果。在肝转移灶个数和肝转移灶手术亚组中,结果显示转移灶数目>2和未接受转移灶手术的患者HR降低更显著,对比两组数据我们发现,由于亚组内样本差异过大,有可能得出假阴性结果,因此仍需要扩大样本量进一步分析。在化疗亚组中,我们发现接受化疗并且同时接受中医药治疗≥6个月的患者,死亡风险显著降低(HR=0.517,pvalue=0.0002)。值得注意的是在KPS评分亚组中,KPS评分90分亚组的HR最低,当KPS分数下降,HR也随之降低;同时仅在KPS>80分的亚组中,中药高暴露的HR获益具有统计学意义(p<0.05)。第二部分:1)测序结果显示:YJD vs Control差异表达基因共490个,上调的基因有326个,下调的基因有164个:QYJD vs Control差异表达基因共4939个,上调的基因有1954个,下调的基因有2985个。QYJD和LUT上调基因中相同的有192个,QYJD和LUT下调基因中相同的有77个。2)按照Fold change由高至低排名,分别列举及注释了祛瘀解毒方组和木犀草素组前10位基因。两组列表中均包含了 KRT6A、KRT17、KRT5、RPPH1四个基因,它们的基因功能分别为角化细胞增殖或迁移、蛋白质合成与上皮细胞生长、糖皮质激素受体调控以及核糖核酸内切酶相关。3)KEGG pathway以及GO分析结显示:祛瘀解毒方功能主要与调节细胞运动、细胞内氧分压相关;涉及JAK-STAT/TGF-β/HIF-1、B细胞受体和细胞因子传递等信号通路。木犀草素主要与调节细胞生长和代谢、血管生成以及细胞外基质稳定性的生物功能相关;涉及感染、脂质及氨基酸代谢等信号通路。第三部分:1)MTS结果显示:HCT116细胞经不同浓度的祛瘀解毒方或木犀草素分别干预24h、48h、72h后,细胞活力逐渐下降,经Oneway-AVONA单因素方差分析具有统计学意义(p<0.05,P<0.01),同时呈现一定的剂量-时间依赖性。2)软琼脂克隆实验结果显示:同空白对照相比,祛瘀解毒方在100、200、400μg/ml浓度分别将克隆数量降低至62.72%,59.83%和58.00%,均有显著差异(P<0.05,P<0.01);7.5μM、15μM和30μM木犀草素分别将克隆形成数量分别降低至82.09%,81.29%和44.68%,与空白对照组相比,仅有30μM木犀草素的抑制作用具有显著差异(P<0.05,P<0.01)。3)荧光素酶报告基因结果显示:给药12h后,祛瘀解毒方在1.25、2.5、5mg/ml均可以显著激活AREs转录,木犀草素在10、20、40μM浓度时均表现出对AREs转录的激活效应,然而只有在40μM时,木犀草素的作用具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。4)qPCR和Western Blotting结果显示,祛瘀解毒方和木犀草素可显著上调Nrf2及下游靶点HO-1、NQ01的mRNA表达,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);在蛋白水平上,其差异并无统计学意义。5)BSP结果显示:在没有处理的HCT116细胞中Nrf2启动子BM-1区DNA甲基化程度大约为60%,被阳性对照药5-Aza处理后的HCT116细胞,甲基化程度降至45%左右,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。另外,无论是祛瘀解毒方还是木犀草素在低剂量时,分别将BM-1区甲基化程度降至54.07%和55.5%,仅呈现去甲基化趋势,其差异并无统计学意义;8mg/ml祛瘀解毒方和30μM木犀草素可显著降低Nrf2启动子BM-1区DNA甲基化程度至44.37%和48%,具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。6)Western Blotting结果显示:祛瘀解毒方对于三种甲基化转移酶均有下调作用,但对于DNMT3b的抑制效应没有统计学意义;木犀草素对于三种甲基化转移酶均可显著抑制其表达,并且呈现一定的剂量依赖特性,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.临床结论接受较长时间中医药治疗的患者在OS上获益更大。中药高暴露组患者中位OS为26.13个月,显著优于低暴露组的14.67个月。此外,我们发现高暴露组的死亡风险显著降低了 53.0%,这与调整后结果基本一致;亚组分析提示KPS评分越高,即患者一般体力状况越好时,中药高暴露可使死亡风险下降越显著,建议在结直肠癌综合治疗中,尽早使用中医药干预,生存获益更大以及更明显。2.实验结论基于高通量测序,我们初步探讨了祛瘀解毒方及其有效单体木犀草素抑制肠癌细胞的可能靶点及途径,并且在后续实验中发现了两种药物可通过去甲基化的表观遗传学调控手段激活Nrf2信号通路,这也为之后更多的验证实验提供了新的研究思路。